Immunomodulýator metabolitler şiş mikro gurşawynyň (TME) esasy aýratynlygydyr, ýöne birnäçe istisnalar bilen, olaryň kimligi köp babatda belli däl. Bu ýerde, biz ýokary derejeli seroz karsinoma (HGSC) bolan näsaglaryň şişlerinden we assitlerinden şişleri we T öýjüklerini seljerdik, bu dürli TME bölümleriniň metabolomyny ýüze çykardyk. Assitleriň we şiş öýjükleriniň metabolitleri uly tapawutlara eýedir. Assitler bilen deňeşdirilende, şişe siňýän T öýjükleri 1-metilnikotinamid (MNA) bilen ep-esli baýdyr. T öýjüklerinde MNA derejesi ýokarlansa-da, nikotinamid N-metiltransferazasynyň (metil toparlarynyň S-adenosilmetioninden nikotinamide geçirilmegini katalizleýän ferment) ekspresiýasy fibroblastlar we şiş öýjükleri bilen çäklenýär. Funksional taýdan MNA T öýjüklerini şişi ösdürýän sitokin şiş nekroz faktory alfany bölüp çykarmaga höweslendirýär. Şonuň üçin TME-den alynýan MNA T öýjükleriniň immun düzgünleşdirilmegine goşant goşýar we adam rakyny bejermek üçin mümkin bolan immunoterapiýa nyşanyny görkezýär.
Şişden alynýan metabolitler şişe garşy immunitete çuňňur päsgel beriji täsir edip biler we has köp subutnamalar olaryň keseliň ösmeginiň esasy hereketlendiriji güýji bolup hem hyzmat edip biljekdigini görkezýär (1). Warburg täsirinden başga-da, soňky döwürde şiş öýjükleriniň metabolik ýagdaýyny we onuň şiş mikro gurşawynyň (TME) immun ýagdaýy bilen baglanyşygyny häsiýetlendirmek üçin işler başlandy. Syçan modelleri we adam T öýjükleri boýunça geçirilen barlaglar glutamin metabolizminiň (2), oksidatiw metabolizmiň (3) we glýukoza metabolizminiň (4) dürli immun öýjükleriniň kiçi toparlaryna garaşsyz täsir edip biljekdigini görkezdi. Bu ýollardaky birnäçe metabolitler T öýjükleriniň şişe garşy funksiýasyny bökdeýär. Tetrahidrobiopterin koenziminiň (BH4) blokadasynyň T öýjükleriniň köpelmegine zyýan ýetirip biljekdigi we bedende BH4-iň köpelmeginiň CD4 we CD8 arkaly şişe garşy immun jogabyny güýçlendirip biljekdigi subut edildi. Mundan başga-da, kinureniniň immunosupressiw täsirini BH4-iň ulanylmagy halas edip bolýar (5). Izositrat dehidrogenaza (IDH) mutant glioblastomasynda enantiometabolik (R)-2-gidroksiglutaratyň (R-2-HG) bölünip çykmagy T öýjükleriniň aktiwleşmesini, köpelmegini we sitoliz işjeňligini basýar (6). Ýakynda glikoliziň goşmaça önümi bolan metilglioksalyň mieloid gelip çykyşly basyjy öýjükler tarapyndan öndürilýändigi we metilglioksalyň T öýjüklerine geçirilmeginiň effektor T öýjükleriniň funksiýasyny basyp biljekdigi görkezildi. Bejergide metilglioksalyň neýtrallaşdyrylmagy mieloid gelip çykyşly basyjy öýjükleriň (MDSC) işjeňligini ýeňip geçip, syçan modellerinde gözegçilik nokadynyň blokada terapiýasyny sinergiki taýdan güýçlendirip biler (7). Bu barlaglar bilelikde TME-den gelip çykyşly metabolitleriň T öýjükleriniň funksiýasyny we işjeňligini düzgünleşdirmekdäki esasy roluny nygtaýar.
Ýumurtgalyk rak keselinde T öýjükleriniň disfunksiýasy giňden habar berildi (8). Bu, bölekleýin, gipoksiýa we şiş damarlarynyň anomaliýasyna mahsus metabolik aýratynlyklar bilen baglanyşyklydyr (9), bu bolsa glýukozanyň we triptofanyň süýt turşusy we kinurenin ýaly goşmaça önümlere öwrülmegine getirýär. Hüjreden daşary laktat aşa köp mukdarda interferon-γ (IFN-γ) öndürilişini azaldýar we mielosupressiw kiçi toparlaryň tapawutlanmagyna sebäp bolýar (10, 11). Triptofanyň sarp edilmegi gönüden-göni T öýjükleriniň köpelmegine päsgel berýär we T öýjük reseptorlarynyň signallaşdyryşyna päsgel berýär (12-14). Bu gözegçiliklere garamazdan, immun metabolizmi bilen baglanyşykly köp iş in vitro T öýjük medeniýetinde optimizirlenen gurşawlar ulanylyp ýa-da in vivo gomologik syçan modelleri bilen çäklenilip geçirildi, bularyň hiç biri adam rak keselleriniň we fiziologiki makro we mikro gurşawyň heterojenligini doly görkezmeýär.
Ýumurtgalyk rak keseliniň umumy alamaty peritoneal ýaýrama we assitleriň peýda bolmagydyr. Assitde öýjük suwuklygynyň toplanmagy keseliň ösen derejesi we ýaramaz prognoz bilen baglanyşyklydyr (15). Habarlara görä, bu özboluşly bölüm gipoksikdir, damar endotelial ösüş faktorynyň (VEGF) we indolamin 2,3-dioksigenazanyň (IDO) ýokary derejesine eýedir we T düzgünleşdiriji öýjükler we mieloid tormozlaýjy öýjükler tarapyndan infiltrasiýa edilýär (15-18). Assitleriň metabolik gurşawy şişiň özünden tapawutly bolup biler, şonuň üçin peritoneal giňişlikde T öýjükleriniň gaýtadan programmalanmagy belli däl. Mundan başga-da, şiş gurşawynda bar bolan assitler we metabolitler arasyndaky esasy tapawutlar we dürlilik immun öýjükleriniň infiltrasiýasyna we olaryň şişlere täsir etmegine päsgel berip biler we mundan beýläk-de ylmy-barlag işleri zerurdyr.
Bu meseleleri çözmek üçin, dürli öýjük görnüşlerini (CD4 + we CD8 + T öýjüklerini goşmak bilen), şeýle hem şişleriň içinde we arasynda öwrenmek üçin duýgur öýjük bölmek we suwuk hromatografiýa tandem massa spektrometriýasy (LC-MS/MS) usulyny işläp düzdik. Onuň metabolitleri hassanyň şol bir assit we şiş gurşawyndaky öýjükleri öz içine alýar. Bu usuly ýokary ölçegli akym sitometriýasy we bir öýjükli RNK yzygiderliligi (scRNA-seq) bilen bilelikde ulanýarys, bu esasy populýasiýalaryň metabolik ýagdaýynyň ýokary derejede anyk portretini berýäris. Bu usul şiş T öýjüklerinde 1-metilnikotinamid (MNA) derejesiniň ep-esli ýokarlanandygyny ýüze çykardy we in vitro tejribeler MNA-nyň T öýjükleriniň işine immunomodulýator täsiriniň öň belli däldigini görkezdi. Umuman, bu usul şişler bilen immun öýjükleriniň arasyndaky özara metabolik özara täsirleri ýüze çykarýar we immun düzgünleşdiriş metabolitleri barada özboluşly düşünjeleri berýär, bu bolsa T öýjüklerine esaslanýan ýumurtgalyk rakynyň immunoterapiýasyny bejermek üçin peýdaly bolup biler. Bejeriş mümkinçilikleri.
Biz glýukozanyň özleşdirilmegini bir wagtyň özünde kesgitlemek üçin ýokary ölçegli akym sitometriýasyny ulandyk [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiglýukoza (2-NBDG) we mitohondrial işjeňlik [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) immun öýjüklerini we şiş öýjükleriniň populýasiýalaryny tapawutlandyrýan tipiki markerlerdir (S2 tablisa we S1A surat). Bu analiz T öýjükleri bilen deňeşdirilende, assitleriň we şiş öýjükleriniň glýukozanyň özleşdirilmeginiň ýokary derejesiniň bardygyny, ýöne mitohondrial işjeňlikde has kiçi tapawutlaryň bardygyny görkezdi. Şiş öýjükleriniň [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ortaça glýukoza özleşdirilmegi T öýjükleriniňkiden üç-dört esse, CD4 + T öýjükleriniň ortaça glýukoza özleşdirilmegi bolsa CD8 + T öýjükleriniňkiden 1,2 esse ýokary, bu bolsa şiş infiltrasiýa edýän limfositleriň (TIL) hatda şol bir TME-de hem dürli metabolik talaplarynyň bardygyny görkezýär (1A surat). Tersine, şiş öýjüklerinde mitohondrial işjeňlik CD4 + T öýjükleriniňkine meňzeýär we iki öýjük görnüşiniň mitohondrial işjeňligi CD8 + T öýjüklerinden ýokarydyr (1B surat). Umuman alanyňda, bu netijeler metabolik derejäni görkezýär. Şiş öýjükleriniň metabolik işjeňligi CD4 + T öýjüklerinden ýokarydyr we CD4 + T öýjükleriniň metabolik işjeňligi CD8 + T öýjüklerinden ýokarydyr. Öýjük görnüşleri boýunça bu täsirlere garamazdan, CD4 + we CD8 + T öýjükleriniň metabolik ýagdaýynda ýa-da olaryň assitlerde şişler bilen deňeşdirilende deňeşdirilen paýlarynda yzygiderli tapawut ýok (1C surat). Tersine, CD45 öýjük fraksiýasynda şişdäki EpCAM+ öýjükleriniň paýy assitler bilen deňeşdirilende ýokarlandy (1D surat). Şeýle hem, EpCAM+ we EpCAM- öýjük bölekleriniň arasynda aýdyň metabolik tapawudy synladyk. EpCAM+ (şiş) öýjüklerinde EpCAM- öýjüklerine garanyňda glýukoza siňdirilişi we mitohondrial işjeňlik has ýokarydyr, bu bolsa TME-däki şiş öýjüklerinde fibroblastlaryň metabolik işjeňliginden has ýokarydyr (1-nji surat, E we F).
(A we B) Glýukozanyň siňdirilişiniň (2-NBDG) ortaça fluoressensiýa intensiwligi (MFI) (A) we CD4 + T öýjükleriniň mitohondrial işjeňligi (MitoTracker goýy gyzyl) (B) Assit we şişden alnan CD8 + T öýjükleriniň we EpCAM + CD45-şiş öýjükleriniň wekilçilikli grafikleri (çepde) we tablisa maglumatlary (Sagda), CD8 + T öýjükleriniň we EpCAM + CD45-şiş öýjükleriniň assit we şişdäki gatnaşygy. (D) Assit we şişdäki (CD45−) EpCAM + şiş öýjükleriniň paýy. (E we F) EpCAM + CD45-şiş we EpCAM-CD45-matris glýukozanyň siňdirilişi (2-NBDG) (E) we mitohondrial işjeňlik (MitoTracker goýy gyzyl) (F) wekilçilikli grafikler (çepde) we tablisa maglumatlary (Sagda) Assit we şiş öýjükleri. (G) Akym sitometriýasy arkaly CD25, CD137 we PD1 ekspresiýasynyň wekilçilikli grafikleri. (H we I) CD4 + T öýjüklerinde (H) we CD8 + T öýjüklerinde (I) CD25, CD137 we PD1 ekspresiýasy. (J we K) CCR7 we CD45RO ekspresiýasyna esaslanýan sada, merkezi ýat (Tcm), effektor (Teff) we effektor ýat (Tem) fenotipleri. Assitlerde we şişlerde CD4 + T öýjükleriniň (J) we CD8 + T öýjükleriniň (K) wekilçilikli suratlary (çepde) we tablisa maglumatlary (sagda). P gymmatlyklary jübüt t-test arkaly kesgitlenýär (*P<0.05, **P<0.01 we ***P<0.001). Setir gabat gelýän näsaglary görkezýär (n = 6). FMO, fluoresensiýa minus bir; MFI, fluoresensiýanyň ortaça intensiwligi.
Mundan beýläk geçirilen seljermeler ýokary derejede çözülen T öýjükleriniň fenotipiki ýagdaýynyň arasyndaky beýleki möhüm tapawutlary ýüze çykardy. Şişlerde aktiwleşdirilen (1-nji surat, G-den I-e çenli) we effektor ýady (1-nji surat, J we K) assitlere (CD3 + T öýjükleriniň paýyna) garanda has köp duş gelýär. Şonuň ýaly-da, aktiwleşdiriş markerleriniň (CD25 we CD137) we tükenme markerleriniň [programmirlenen öýjük ölümi belogy 1 (PD1)] ekspresiýasy boýunça fenotipi seljermek, bu populýasiýalaryň metabolik häsiýetleriniň tapawutly bolsa-da (S1-nji surat, B-den E-e çenli), ýöne naiw, effektor ýa-da ýatdaşlyk alt toplumlarynyň arasynda yzygiderli möhüm metabolik tapawutlaryň synalmandygyny görkezdi (S1-nji surat, F-den I-e çenli). Bu netijeler öýjük fenotiplerini awtomatiki kesgitlemek üçin maşyn öwrenmek usullaryny ulanmak arkaly tassyklanyldy (21), bu bolsa hassanyň assitlerinde köp sanly süňk ýiligi öýjükleriniň (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) bardygyny has-da ýüze çykardy (S2A-njy surat). Ähli anyklanan öýjük görnüşleriniň arasynda bu mieloid öýjük populýasiýasy iň ýokary glýukoza siňdirilişini we mitohondrial işjeňligi görkezdi (S2 surat, B-dan G-a çenli). Bu netijeler HGSC näsaglarynda assitlerde we şişlerde duş gelýän köp öýjük görnüşleriniň arasyndaky güýçli metabolik tapawutlary görkezýär.
TIL-iň metabonomik aýratynlyklaryny düşünmekde esasy kynçylyk, şişlerden ýeterlik arassalyk, hil we mukdardaky T öýjük nusgalaryny bölüp almak zerurlygydyr. Soňky barlaglar akym sitometriýasyna esaslanýan sortlamak we munjuk baýlaşdyrmak usullarynyň öýjük metabolit profillerinde üýtgeşmelere getirip biljekdigini görkezdi (22-24). Bu meseläni çözmek üçin, LC-MS/MS arkaly analizden öň hirurgiki ýol bilen kesilen adam ýumurtgalyk rak keselinden TIL-i bölüp almak we bölüp almak üçin munjuk baýlaşdyrmak usulyny optimizirledik (Materiallar we usullar; 2A surat). Bu protokolyň metabolit üýtgeşmelerine umumy täsirini bahalandyrmak üçin, ýokardaky munjuk bölüniş ädiminden soň sagdyn donorlar tarapyndan aktiwleşdirilen T öýjükleriniň metabolit profillerini munjuk bölünmedik, ýöne buzda galan öýjükler bilen deňeşdirdik. Bu hil gözegçiligi seljermesi bu iki şertiň arasynda ýokary arabaglanyşygyň bardygyny (r = 0.77) we 86 metabolit toparynyň tehniki gaýtalanma ukybynyň ýokary gaýtalanma ukybyna eýedigini anyklady (2B surat). Şonuň üçin bu usullar öýjük görnüşini baýlaşdyrýan öýjüklerde takyk metabolit analizini geçirip bilýär, şeýlelik bilen HGSC-de belli metabolitleri kesgitlemek üçin ilkinji ýokary çözgütli platformany üpjün edýär we şeýlelik bilen adamlara öýjük spesifikasiýasyny çuňňur düşünmäge mümkinçilik berýär. Jynsy metabolizm programmasy.
(A) Magnit monjuk baýlaşdyrmagyň shematiki diagrammasy. LC-MS/MS arkaly seljerilmezden öň, öýjükler magnit monjuk baýlaşdyrmagyň yzly-yzyna üç tapgyryndan geçer ýa-da buzda galar. (B) Baýlaşdyryş görnüşiniň metabolitleriň köplügine täsiri. Her baýlaşdyryş görnüşi üçin üç ölçegiň ortaça bahasy ± SE. Çal çyzyk 1:1 gatnaşygyny görkezýär. Gaýtalanýan ölçegleriň synp içi korrelýasiýasy (ICC) ok belgisinde görkezilen. NAD, nikotinamid adenin dinukleotidi. (C) Näsag metabolit analiziniň iş akymynyň shematiki diagrammasy. Assitler ýa-da şişler näsaglardan ýygnalýar we kriokonserwasiýa edilýär. Her nusganyň kiçi bir bölegi akym sitometriýasy arkaly seljerildi, galan nusgalar bolsa CD4+, CD8+ we CD45- öýjükleri üçin üç tapgyr baýlaşdyryşdan geçdi. Bu öýjük fraksiýalary LC-MS/MS ulanyp seljerildi. (D) Standartlaşdyrylan metabolitleriň köplüginiň ýylylyk kartasy. Dendrogram nusgalaryň arasyndaky Ýewklid aralyklarynyň Wardyň klasterleşdirilişini görkezýär. (E) Her nusganyň üç gaýtalanmasyny görkezýän nusga metabolit kartasynyň esasy komponent analizi (PCA), şol bir hassanyň nusgalary çyzyk arkaly birikdirilendir. (F) Hassanyň metabolit profiliniň PCA-sy (ýagny bölekleýin artykmaçlygy ulanmak); nusganyň görnüşi gapak gabyk bilen çäklendirilendir. PC1, esasy komponent 1; PC2, esasy komponent 2.
Soňra, biz bu baýlaşdyryş usulyny alty HGSC hassasynyň esasy assitlerinde we şişlerinde CD4+, CD8+ we CD45-hüjre fraksiýalarynda 99 metabolitleri seljermek üçin ulandyk (2C surat, S3A surat we S3 we S4 tablisalary). Gyzyklanylýan ilat asyl uly diri öýjük nusgasynyň 2% -den 70% -ine çenlisini düzýär we öýjükleriň paýy hassalaryň arasynda örän üýtgeýär. Munjaklary bölenden soň, baýlaşdyrylan gyzyklanma fraksiýasy (CD4+, CD8+ ýa-da CD45-) nusgadaky ähli diri öýjükleriň ortaça 85% -den gowragyny düzýär. Bu baýlaşdyryş usuly bize adam şiş dokumalarynyň metabolizminden öýjük populýasiýalaryny seljermäge mümkinçilik berýär, muny uly nusgalardan etmek mümkin däl. Bu protokoly ulanyp, biz l-kinurenin we adenozin, bu iki gowy häsiýetlendirilýän immunosupressiw metabolitleriň şiş T öýjüklerinde ýa-da şiş öýjüklerinde ýokarlanandygyny anykladyk (S3, B we C suratlary). Şonuň üçin bu netijeler biziň öýjükleri bölmek we massa spektrometriýasy tehnologiýamyzyň hassa dokumalarynda biologik taýdan möhüm metabolitleri tapmak üçin ygtybarlylygyny we ukybyny görkezýär.
Şeýle hem, biziň seljermämiz hassalaryň içinde we arasynda öýjük görnüşleriniň güýçli metabolik bölünişini ýüze çykardy (2D surat we S4A surat). Hususan-da, beýleki hassalar bilen deňeşdirilende, 70-nji hassa dürli metabolik häsiýetleri görkezdi (2E surat we S4B surat), bu bolsa hassalaryň arasynda düýpli metabolik dürliligiň bolup biljekdigini görkezýär. Beýleki hassalar bilen deňeşdirilende (1,2-2 litr; S1 tablisa), 70-nji hassada ýygnalan assitleriň umumy mukdarynyň (80 ml) az bolandygyny bellemek gerek. Esasy komponent seljermesiniň dowamynda (meselem, bölekleýin artykmaçlyk seljermesini ulanmak bilen) hassalar arasyndaky dürliligiň gözegçiligi öýjük görnüşleriniň arasyndaky yzygiderli üýtgeşmeleri görkezýär we öýjük görnüşleri we/ýa-da mikro gurşaw metabolit profiline görä aýdyň jemlenendir (2F surat). Ýeke metabolitleriň seljermesi bu täsirleri nygtaýar we öýjük görnüşleri bilen mikro gurşawyň arasyndaky möhüm tapawutlary ýüze çykarýar. Synalan iň ekstremal tapawudyň adatça CD45- öýjüklerinde we şişe siňýän CD4+ we CD8+ öýjüklerinde baýlaşan MNAdygyny bellemek gerek (3A surat). CD4 + öýjükleri üçin bu täsir has aýdyň görünýär we CD8 + öýjüklerindäki MNA-a daşky gurşaw hem güýçli täsir edýän ýaly. Şeýle-de bolsa, bu möhüm däl, sebäbi alty hassanyň diňe üçüsi şiş CD8 + ballary üçin bahalandyrylyp bilner. MNA-dan başga-da, assitlerde we şişlerde dürli görnüşli öýjüklerde, TIL-de ýaramaz häsiýetlendirilýän beýleki metabolitler hem dürli derejede baýdyr (S3 we S4 suratlar). Şonuň üçin bu maglumatlar mundan beýläkki barlaglar üçin geljegi uly immunomodulýator metabolitler toplumyny açyp görkezýär.
(A) Assit we şişden CD4+, CD8+ we CD45- öýjüklerinde MNA-nyň normallaşdyrylan mazmuny. Guty diagrammasynda kwartil aralygynyň (çarçuwanyň menteşesi) we maglumat aralygy kwartil aralygynyň (çarçuwanyň murty) 1,5 essesine çenli görkezilýär. Näsagyň materiallary we usullary bölüminde beýan edilişi ýaly, P gymmatyny kesgitlemek üçin näsagyň limma gymmatyny ulanyň (*P<0,05 we **P<0,01). (B) MNA metabolizminiň shematiki diagrammasy (60). Metabolitler: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-gomosistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotidi. Fermentler (ýaşyl): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, syrtuinler; NAMPT, nikotinamid fosforiboziltransferaza; AOX1, aldegid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribosid kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purin nukleozid fosforilaza. (C) Assitleriň (çal) we şişiň scRNA-seksiýasynyň t-SNE-si (gyzyl; n = 3 hassa). (D) scRNA-seksiýasy arkaly anyklanan dürli öýjük populýasiýalarynda NNMT ekspresiýasy. (E) SK-OV-3-de, adam embrion böwreginde (HEK) 293T-de, T öýjüklerinde we MNA bilen bejerilen T öýjüklerinde NNMT we AOX1 ekspresiýasy. Gatlanan ekspresiýa SK-OV-3-e görä görkezilýär. SEM bilen ekspresiýa nusgasy görkezilýär (n = 6 sagdyn donor). 35-den ýokary Ct gymmatlyklary anyklanyp bilinmeýän hasaplanýar (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T öýjüklerinde we 8mM MNA bilen işlenen T öýjüklerinde SLC22A1 we SLC22A2 ekspresiýasy. Gatlanan ekspresiýa SK-OV-3 bilen deňeşdirilende görkezilýär. SEM bilen ekspresiýa nusgasy görkezilýär (n = 6 sagdyn donor). 35-den ýokary Ct gymmatlyklary anyklanyp bilinmeýän hasaplanýar (UD). (G) MNA bilen 72 sagat inkubasiýadan soň aktiwleşdirilen sagdyn donor T öýjüklerinde öýjük MNA mukdary. SEM bilen ekspresiýa nusgasy görkezilýär (n = 4 sagdyn donor).
MNA, nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; 3B surat) arkaly S-adenozil-1-metioninden (SAM) metil toparyny nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; 3B surat) arkaly nikotinamide (NA) geçirmek arkaly öndürilýär. NNMT dürli adam rak kesellerinde artykmaç ekspresirlenýär we proliferasiýa, inwaziýa we metastaz bilen baglanyşyklydyr (25-27). TME-däki T öýjüklerinde MNA-nyň çeşmesini has gowy düşünmek üçin, üç HGSC hassasynyň assitlerinde we şişlerinde NNMT-niň öýjük görnüşleri boýunça ekspresiýasyny häsiýetlendirmek üçin scRNA-seq ulandyk (S5 tablisa). Takmynan 6500 öýjügiň seljermesi, assitlerde we şiş gurşawynda NNMT ekspresiýasynyň çaklanylýan fibroblast we şiş öýjük populýasiýalary bilen çäklenendigini görkezdi (3-nji surat, C we D). PTPRC (CD45 +) ekspresirleýän hiç bir populýasiýada açyk NNMT ekspresiýasynyň ýokdugyny bellemek gerek (3D surat we S5A surat), bu bolsa metabolit spektrinde anyklanan MNA-nyň T öýjüklerine girizilendigini görkezýär. Aldegid oksidaza 1-iň (AOX1) ekspresiýasy MNA-ny 1-metil-2-piridon-5-karboksamide (2-PYR) ýa-da 1-metil-4-piridon-5-karboksamide (4-PYR) öwürýär; 3B surat) şeýle hem COL1A1 ekspresiýa edýän fibroblastlaryň populýasiýasy bilen çäklenýär (S5A surat), bu bolsa T öýjükleriniň adaty MNA metabolizminiň ukybynyň ýokdugyny görkezýär. Bu MNA bilen baglanyşykly genleriň ekspresiýa nusgasy HGSC näsaglaryndan alnan assitlerden alnan ikinji garaşsyz öýjük maglumatlarynyň toplumy arkaly tassyklanyldy (S5B surat; n = 6) (16). Mundan başga-da, MNA bilen bejerilen sagdyn donor T öýjükleriniň mukdary polimeraza zynjyr reaksiýasy (qPCR) seljermesi gözegçilik SK-OV-3 ýumurtgalyk şiş öýjükleri bilen deňeşdirilende, NNMT ýa-da AOX1-iň diýen ýaly ekspresiýa edilmeýändigini görkezdi (3E surat). Bu garaşylmadyk netijeler MNA-nyň fibroblastlardan ýa-da şişlerden TME-däki goňşy T öýjüklerine bölünip çykmagynyň mümkindigini görkezýär.
Kandidatlar ereýän daşaýjy 22 (SLC22) maşgalasy (SLC22A1, SLC22A2 we SLC22A3) tarapyndan kodlanan 1-den 3-e çenli organiki kation daşaýjylar maşgalasyny (OKT1, OCT2 we OCT3) öz içine alsa-da, MNA-nyň potensial daşaýjylary henizem kesgitlenmedik (28). Sagdyn donor T öýjüklerinden alynýan mRNA-nyň QPCR-i SLC22A1-iň pes ekspresiýa derejesini görkezdi, ýöne SLC22A2-niň anyklanyp bilinmeýän derejesini görkezdi, bu bolsa onuň edebiýatda öň habar berlendigini tassyklady (3F surat) (29). Tersine, SK-OV-3 ýumurtgalyk şiş öýjük liniýasy iki daşaýjynyň hem ýokary derejesini görkezdi (3F surat).
T öýjükleriniň daşary ýurt MNA-ny özüne siňdirip bilmek ukybynyň bardygyny barlamak üçin, sagdyn donor T öýjükleri MNA-nyň dürli konsentrasiýalarynyň gatnaşmagynda 72 sagatlap ösdürilip ýetişdirildi. Ekzogen MNA bolmadyk ýagdaýynda, MNA-nyň öýjükdäki mazmunyny anyklap bolmaýar (3G surat). Şeýle-de bolsa, ekzogen MNA bilen bejerilen aktiwleşdirilen T öýjükleri öýjüklerde MNA-nyň mukdarynyň doza bagly artmagyny, 6 mM MNA çenli görkezdi (3G surat). Bu netije, daşaýjy ekspresiýanyň pes derejesine we öýjük içindäki MNA metabolizmi üçin jogapkär esasy fermentiň ýoklugyna garamazdan, TIL-iň MNA-ny özleşdirip biljekdigini görkezýär.
Näsaglaryň T öýjüklerindäki metabolitleriň spektri we in vitro MNA siňdiriş tejribeleri rak bilen baglanyşykly fibroblastlaryň (CAF) MNA bölüp çykarmagynyň we şiş öýjükleriniň TIL-iň fenotipini we funksiýasyny düzgünleşdirmeginiň mümkinçiligini artdyrýar. MNA-nyň T öýjüklerine täsirini kesgitlemek üçin sagdyn donor T öýjükleri MNA-nyň barlygynda ýa-da ýoklugynda in vitro işjeňleşdirildi we olaryň köpelmegi we sitokin önümçiligi bahalandyryldy. MNA-ny iň ýokary dozada goşandan 7 gün soň, ilatyň iki esse köpelmegi ortaça azaldy, şol bir wagtyň özünde ähli dozalarda güýç saklandy (4A surat). Mundan başga-da, ekzogen MNA-ny bejermek şiş nekroz faktoryny-α görkezýän CD4 + we CD8 + T öýjükleriniň paýynyň artmagyna getirdi (TNFα; 4B surat). Tersine, IFN-γ-nyň öýjük içi önümçiligi CD4 + T öýjüklerinde ep-esli azaldy, ýöne CD8 + T öýjüklerinde däldi we interleýkin 2-de ep-esli üýtgeşiklik bolmady (IL-2; 4-nji surat, C we D). Şonuň üçin, bu MNA bilen bejerilen T öýjük medeniýetlerinden alynýan üstki gatlaklaryň ferment bilen baglanyşykly immunosorbent derňewi (ELISA) TNFα-nyň ep-esli artmagyny, IFN-γ-nyň azalmagyny we IL-2-niň üýtgemeýändigini görkezdi (4-nji surat, E-den G-e çenli). . IFN-γ-nyň azalmagy MNA-nyň T öýjükleriniň şişe garşy işjeňliginiň öňüni almakda rol oýnap biljekdigini görkezýär. MNA-nyň T öýjükleriniň sitotoksikligine täsirini simulýasiýa etmek üçin, folat reseptory α we ýaşyl fluoressent belok (GFP) -CAR-T) öýjükleri tarapyndan düzgünleşdirilýän CAR-T (GFP) nyşana alýan himer antigen reseptory T (FRα-CAR-T) öýjükleri sagdyn donor periferik gan mononuklear öýjükleri (PBMC) tarapyndan öndürilýär. CAR-T öýjükleri MNA-nyň gatnaşmagynda 24 sagatlap ösdürilip ýetişdirildi, soňra effektor-nyşan gatnaşygy 10:1 bolanda folat reseptory α-ny ekspresirleýän adam SK-OV-3 ýumurtgalyk şiş öýjükleri bilen bilelikde ösdürilip ýetişdirildi. MNA bejergisi FRα-CAR-T öýjükleriniň öldüriji işjeňliginiň ep-esli peselmegine getirdi, bu bolsa adenozin bilen bejerilen FRα-CAR-T öýjüklerine meňzeşdi (4H surat).
(A) 7-nji günde medeniýetden gönüden-göni alnan umumy ýaşaýyşa ukyply öýjük sany we populýasiýanyň iki esse köpelmegi (PD). Sütun grafik alty sagdyn donoryň ortaça + SEM-ni görkezýär. Iň bolmanda n = 3 garaşsyz tejribeden alnan maglumatlary görkezýär. (B-dan D-a) CD3/CD28 we IL-2 T öýjüklerini degişli MNA konsentrasiýalarynda 7 günläp işjeňleşdirmek üçin ulanyldy. Analizden öň, öýjükler GolgiStop bilen PMA/ionomisin bilen 4 sagatlap höweslendirildi. T öýjüklerinde TNFα (B) ekspresiýasy. Diri öýjüklerde TNFα ekspresiýasynyň mysal suraty (çepde) we tablisa maglumatlary (sagda). T öýjüklerinde IFN-γ (C) we IL-2 (D) ekspresiýasy. Sitokinleriň ekspresiýasy akym sitometriýasy bilen ölçeldi. Sütun grafik ortaça (n = 6 sagdyn donor) + SEM-ni görkezýär. P gymmatyny kesgitlemek üçin birtaraplaýyn dispersiýa analizini we gaýtalanýan ölçegleri ulanyň (*P<0.05 we **P<0.01). Iň bolmanda n = 3 garaşsyz tejribeden alnan maglumatlary görkezýär. (E-den G-e çenli) CD3/CD28 we IL-2 T öýjüklerini degişli MNA konsentrasiýalarynda 7 günläp işjeňleşdirmek üçin ulanyldy. Suratlar PMA/ionomisin stimulýasiýasynyň 4 sagadyndan öň we soň ýygnaldy. TNFα (E), IFN-γ (F) we IL-2 (G) konsentrasiýalary ELISA arkaly ölçeldi. Sütun grafik ortaça (n = 5 sagdyn donor) + SEM-i görkezýär. P gymmaty birtaraplaýyn dispersiýa analizi we gaýtalanýan ölçegler arkaly kesgitlenildi (*P<0.05). Nokatly çyzyk anyklamanyň anyklaýyş çägini görkezýär. (H) Öýjük lizisi synagy. FRα-CAR-T ýa-da GFP-CAR-T öýjükleri 24 sagatlap adenozin (250μM) ýa-da MNA (10 mM) bilen sazlandy ýa-da bejerilmedi (Ctrl). SK-OV-3 öýjükleriniň öldürilme prosenti ölçeldi. P gymmaty Welch t synagy arkaly kesgitlenildi (*P<0.5 we **P<0.01).
MNA-garaşly TNFα ekspresiýasynyň düzgünleşdirilmeginiň mehanistik düşünjesini almak üçin, MNA bilen bejerilen T öýjükleriniň TNFα mRNA-syndaky üýtgeşmeler bahalandyryldy (5A surat). MNA bilen bejerilen sagdyn donor T öýjüklerinde TNFα transkripsiýa derejesiniň iki esse ýokarlanmagy görkezildi, bu bolsa MNA-nyň TNFα transkripsiýa düzgünleşdirilmegine baglydygyny görkezýär. Bu mümkin bolan düzgünleşdiriji mehanizmi öwrenmek üçin, TNFα-ny düzgünleşdirýän iki belli transkripsiýa faktory, ýagny aktiwleşdirilen T öýjük ýadro faktory (NFAT) we spesifik belok 1 (Sp1), proksimal TNFα promotoryna MNA baglanmagyna jogap hökmünde bahalandyryldy (30). TNFα promotory bir ýerde gabat gelýän 6 sany anyklanan NFAT baglanyş ýerini we 2 sany Sp1 baglanyş ýerini öz içine alýar [5'kapakdan -55 esas jübüt (bp)] (30). Hromatin immunopresipitasiýa (ChIP) MNA bilen bejerilende, Sp1-iň TNFα promotoryna baglanyşynyň üç esse ýokarlanandygyny görkezdi. NFAT-yň goşulmagy hem ýokarlandy we ähmiýetine ýakynlaşdy (5B surat). Bu maglumatlar MNA-nyň TNFα-nyň Sp1 transkripsiýasy arkaly we has az derejede NFAT-yň ekspresiýasyny düzgünleşdirýändigini görkezýär.
(A) MNA-syz ösdürilip ýetişdirilen T öýjükleri bilen deňeşdirilende, MNA bilen bejerilen T öýjüklerinde TNFα ekspresiýasynyň gatlak üýtgemesi. SEM bilen ekspresiýa nusgasy görkezilýär (n = 5 sagdyn donor). Iň bolmanda n = 3 garaşsyz synagdan alnan maglumatlary görkezýär. (B) NFAT we Sp1 4 sagatlap (Ctrl) we PMA/ionomisin stimulýasiýasy bilen utgaşdyrylandan soň 8 mM MNA bilen ýa-da onsuz bejerilen T öýjükleriniň TNFα promotory. Immunoglobulin G (IgG) we H3 immunopresipitasiýa üçin degişlilikde negatiw we oňyn gözegçilik hökmünde ulanyldy. ChIP-iň mukdary MNA bilen bejerilen öýjüklerde Sp1 we NFAT-yň TNFα promotoryna baglanmagynyň gözegçilik bilen deňeşdirilende birnäçe esse artandygyny görkezdi. Iň bolmanda n = 3 garaşsyz synagdan alnan maglumatlary görkezýär. Köp sanly t-testler arkaly kesgitlenen P gymmaty (*** P <0.01). (C) HGSC-niň assitleri bilen deňeşdirilende, T öýjükleri (sitotoksik däl) şişde TNF ekspresiýasynyň artandygyny görkezdi. Reňkler dürli hassalary görkezýär. Görkezilen öýjükler tötänleýin 300-e çenli nusga alyndy we artykmaç çekilmegi çäklendirmek üçin titräp başlady (** Padj = 0.0076). (D) Ýumurtgalyk rak keseli üçin MNA-nyň teklip edilýän modeli. MNA TME-de şiş öýjüklerinde we fibroblastlarda öndürilýär we T öýjükleri tarapyndan kabul edilýär. MNA Sp1-iň TNFα promotoryna baglanyşyny artdyrýar, bu bolsa TNFα transkripsiýasynyň we TNFα sitokin önümçiliginiň artmagyna getirýär. MNA şeýle hem IFN-γ-nyň azalmagyna sebäp bolýar. T öýjükleriniň işiniň basylyp saklanmagy öldürmek ukybynyň peselmegine we şişiň ösüşiniň çaltlaşmagyna getirýär.
Habarlara görä, TNFα öň we arka taýdan garaşly şişe garşy we şişe garşy täsirlere eýedir, ýöne ol ýumurtgalyk rakynyň ösüşini we metastazyny höweslendirmekde belli rol oýnaýar (31-33). Habarlara görä, ýumurtgalyk raky bolan näsaglarda assitde we şiş dokumalarynda TNFα-nyň konsentrasiýasy gowy däl dokumalara garanyňda ýokarydyr (34-36). Mehanizm babatda TNFα ak gan öýjükleriniň aktiwleşmesini, işini we köpelmegini düzgünleşdirip, rak öýjükleriniň fenotipini üýtgedip biler (37, 38). Bu netijelere laýyklykda, differensial gen ekspresiýasynyň seljermesi TNF-iň şiş dokumalarynda assit bilen deňeşdirilende ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi (5C surat). TNF ekspresiýasynyň ýokarlanmagy diňe sitotoksik däl fenotipli T öýjük populýasiýalarynda ýüze çykdy (S5A surat). Gysgaça aýdylanda, bu maglumatlar MNA-nyň HGSC-de iki immunosupressiw we şişi höweslendiriji täsirleriniň bardygy baradaky pikiri goldaýar.
Akym sitometriýasyna esaslanýan flüoresan etiketka TIL metabolizmini öwrenmek üçin esasy usul boldy. Bu barlaglar periferik gan limfositleri ýa-da ikinji derejeli limfoid organlardan alnan T öýjükleri bilen deňeşdirilende, syçanlaryň we adamyň TIL-leriniň glýukozany özleşdirmäge has ýokary meýillidigini (4, 39) we mitohondrial funksiýanyň kem-kemden ýitýändigini (19, 40) görkezdi. Bu barlagda meňzeş netijeleri synlasak-da, esasy ösüş şol bir kesilen şiş dokumasyndan şiş öýjükleriniň metabolizmini we TIL-i deňeşdirmekdir. Öňki hasabatlaryň käbirine laýyklykda, assitlerden we şişlerden dörän şiş (CD45-EpCAM +) öýjükleri CD8 + we CD4 + T öýjüklerine garanyňda has ýokary glýukozany özleşdirýär, bu bolsa şiş öýjükleriniň ýokary glýukozany özleşdirmeginiň T öýjükleri bilen deňeşdirilip bilinjekdigini goldaýar. T öýjükleriniň bäsdeşligi düşünjesi. TME. Şeýle-de bolsa, şiş öýjükleriniň mitohondrial işjeňligi CD8 + T öýjüklerinden has ýokary, ýöne mitohondrial işjeňlik CD4 + T öýjüklerine meňzeş. Bu netijeler oksidatiw metabolizmiň şiş öýjükleri üçin möhümdigi baradaky täze temany güýçlendirýär (41, 42). Şeýle hem, olar CD8 + T öýjükleriniň CD4 + T öýjüklerine garanda oksidatiw disfunksiýa has duýgur bolup biljekdigini ýa-da CD4 + T öýjükleriniň mitohondrial işjeňligi saklamak üçin glýukozadan başga uglerod çeşmelerini ulanyp biljekdigini çaklaýarlar (43, 44). Assitlerde CD4 + T effektorlarynyň, T effektor ýadynyň we T merkezi ýadynyň öýjükleriniň arasynda glýukoza siňdirilişinde ýa-da mitohondrial işjeňlikde hiç hili tapawut görmändigimizi bellemelidiris. Şonuň ýaly-da, şişlerde CD8 + T öýjükleriniň differensiasiýa ýagdaýynyň glýukoza siňdirilişindäki üýtgeşmeler bilen hiç hili baglanyşygy ýok, bu bolsa in vitro ösdürilip ýetişdirilen T öýjükleri bilen in vivo adam TIL-iniň arasyndaky möhüm tapawudy görkezýär (22). Bu gözegçilikler şeýle hem awtomatiki öýjük ilatynyň garaşsyz bölünip berilmegi bilen tassyklanyldy, bu bolsa şiş öýjüklerine garanda glýukoza siňdirilişi we mitohondrial işjeňligi ýokary bolan CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + öýjükleriniň ýaýrandygyny, ýöne metabolik işjeň öýjük ilatynyň bardygyny görkezdi. Bu ilat scRNA-seq analizinde kesgitlenen mieloid basyş ediji öýjükleriň ýa-da plazmatsitoid dendritik öýjükleriň çak edilýän kiçi populýasiýasyny görkezip biler. Bularyň ikisi hem adam ýumurtgalyklarynyň şişlerinde habar berlen hem bolsa [45], olar henizem bu mieloid kiçi populýasiýasyny beýan etmek üçin goşmaça iş alyp barmaly.
Akym sitometriýasyna esaslanýan usullar öýjük görnüşleriniň arasyndaky glýukoza we oksidatiw metabolizmdäki umumy tapawutlary aýdyňlaşdyryp bilse-de, TME-de mitohondrial metabolizm üçin glýukoza ýa-da beýleki uglerod çeşmeleri tarapyndan öndürilen takyk metabolitler heniz kesgitlenmedi. Metabolitleriň bardygyny ýa-da ýokdugyny berlen TIL kiçi toparyna bellemek üçin öýjük populýasiýasyny kesilen dokumadan arassalamak gerek. Şonuň üçin, öýjük baýlaşdyrmak usulymyz massa spektrometriýasy bilen utgaşdyrylanda, gabat gelýän hassalaryň nusgalarynda T öýjüklerinde we şiş öýjük populýasiýalarynda dürli derejede baýlaşdyrylan metabolitler barada düşünje berip biler. Bu usulyň fluoresensiýa bilen aktiwleşdirilen öýjükleri bölmekden artykmaçlyklary bolsa-da, käbir metabolit kitaphanalaryna içki durnuklylyk we/ýa-da çalt aýlanyş tizligi sebäpli täsir edip biler (22). Şeýle-de bolsa, usulymyz iki ykrar edilen immunosupressiw metabolitleri, adenozin we kynurenini anyklap bildi, sebäbi olar nusga görnüşleriniň arasynda örän tapawutlanýar.
Şişleriň we TIL kiçi görnüşleriniň metabonomik analizimiz ýumurtgalyk TME-de metabolitleriň roluny has giňişleýin düşündirýär. Birinjiden, akym sitometriýasyny ulanyp, şişler bilen CD4 + T öýjükleriniň arasynda mitohondrial işjeňlikde hiç hili tapawut ýokdugyny anykladyk. Şeýle-de bolsa, LC-MS/MS analizi bu ilatlaryň arasynda metabolitleriň köplüginde düýpli üýtgeşmeleri ýüze çykardy, bu bolsa TIL metabolizmi we onuň umumy metabolik işjeňligi baradaky netijeleriň ünsli düşündirmegi talap edýändigini görkezýär. Ikinjiden, MNA, şişler däl-de, assitlerde CD45 öýjükleri we T öýjükleri arasynda iň uly tapawut bolan metabolitdir. Şonuň üçin, bölmek we şişiň ýerleşýän ýeri TIL metabolizmine dürli täsir edip biler, bu bolsa belli bir mikro gurşawda mümkin bolan dürliligi görkezýär. Üçünjiden, MNA öndürýän NNMT fermentiniň ekspresiýasy esasan CAF bilen çäklenýär, ol has az derejede şiş öýjükleridir, ýöne şişden alynýan T öýjüklerinde anyklanyp bilinýän MNA derejeleri syn edilýär. Ýumurtgalyk CAF-da NNMT-niň artykmaç ekspresiýasy belli bir rak keselini ösdürýän täsire eýedir, bu bölekleýin CAF metabolizminiň, şişiň çozuşynyň we metastazynyň höweslendirilmegi bilen baglanyşyklydyr (27). TIL-iň umumy derejesi ortaça bolsa-da, CAF-da NNMT-niň ekspresiýasy Rak Genom Atlasynyň (TCGA) mezenhimal görnüşi bilen ýakyndan baglanyşyklydyr, bu bolsa ýaramaz prognoz bilen baglanyşyklydyr (27, 46, 47). Ahyrsoňy, MNA-nyň dargamagyna jogapkär AOX1 fermentiniň ekspresiýasy hem CAF ilaty bilen çäklenýär, bu bolsa T öýjükleriniň MNA-ny metabolizirlemek ukybynyň ýokdugyny görkezýär. Bu netijeler bu netijäni barlamak üçin goşmaça işleriň zerurdygyna garamazdan, T öýjüklerinde MNA-nyň ýokary derejesi immunosupressiw CAF mikro gurşawynyň bardygyny görkezip biljekdigi baradaky pikiri goldaýar.
MNA daşaýjylarynyň pes ekspresiýa derejesini we MNA metabolizmine gatnaşýan esasy beloklaryň anyklanyp bilinmeýän derejesini göz öňünde tutup, T öýjüklerinde MNA-nyň bolmagy garaşylmadyk ýagdaýdyr. NNMT-ni hem, AOX1-i hem scRNA-seq analizi we iki garaşsyz kohortanyň maksatly qPCR-i arkaly anyklap bolmady. Bu netijeler MNA-nyň T öýjükleri tarapyndan sintezlenmän, töweregindäki TME-den siňdirilýändigini görkezýär. In vitro tejribeler T öýjükleriniň ekzogen MNA toplamaga meýillidigini görkezýär.
In vitro barlaglarymyz ekzogen MNA-nyň T öýjüklerinde TNFα ekspresiýasyny döredýändigini we Sp1-iň TNFα promotoryna baglanyşyny güýçlendirýändigini görkezdi. TNFα-nyň hem şişe garşy, hem-de şişe garşy funksiýalary bar bolsa-da, ýumurtgalyk rakynda TNFα ýumurtgalyk rakynyň ösüşini höweslendirip biler (31-33). Ýumurtgalyk şiş öýjükleriniň medeniýetinde TNFα-nyň neýtrallaşdyrylmagy ýa-da syçan modellerinde TNFα signalynyň ýok edilmegi TNFα arkaly iltihaplanma sitokinleriniň öndürilişini gowulandyryp we şişiň ösüşini basyp ýatyryp biler (32, 35). Şonuň üçin, bu ýagdaýda, TME-den alynýan MNA awtokrin halkasy arkaly TNFα-garaşly mehanizm arkaly iltihaplanmany öňe sürýän metabolit hökmünde hereket edip biler we şeýdip ýumurtgalyk rakynyň ýüze çykmagyna we ýaýramagyna ýardam edip biler (31). Bu mümkinçilik esasynda, TNFα blokadasy ýumurtgalyk raky üçin potensial terapewtiki serişde hökmünde öwrenilýär (37, 48, 49). Mundan başga-da, MNA CAR-T öýjükleriniň ýumurtgalyk şiş öýjüklerine sitotoksikligini peseldýär we MNA arkaly immun basyşynyň goşmaça subutnamalaryny berýär. Bu netijeler umumylykda şişleriň we CAF öýjükleriniň MNA-ny öýjük daşyndaky TME-e bölüp çykarýan modelini görkezýär. (i) TNF tarapyndan döredilen ýumurtgalyk rakynyň ösüşini höweslendirmek we (ii) MNA tarapyndan döredilen T öýjükleriniň sitotoksik işjeňliginiň basylyp saklanmagy arkaly bu iki şiş täsirine eýe bolup biler (5D surat).
Netijede, çalt öýjük baýlaşdyrmagyň, bir öýjükli yzygiderliligiň we metabolik profilleşdirmegiň utgaşmasyny ulanmak arkaly bu gözleg HGSC näsaglarynda şişler we assit öýjükleriniň arasyndaky uly immunometabolomiki tapawutlary ýüze çykardy. Bu giňişleýin seljerme T öýjükleriniň arasynda glýukozanyň siňdirilişinde we mitohondrial işjeňlikde tapawutlaryň bardygyny görkezdi we MNA-ny öýjük däl özbaşdak immun düzgünleşdiriji metabolit hökmünde kesgitledi. Bu maglumatlar TME-niň adam rak kesellerinde T öýjükleriniň metabolizmasyna nähili täsir edýändigine täsir edýär. T öýjükleri bilen rak öýjükleriniň arasyndaky iýmit maddalary üçin gönüden-göni bäsdeşlik barada habar berilse-de, metabolitler şişiň ösüşini höweslendirmek we endogen immun jogaplaryny basyp ýatyrmak üçin gytaklaýyn düzgünleşdiriji hökmünde hem hereket edip bilerler. Bu düzgünleşdiriji metabolitleriň funksional rolunyň has giňişleýin beýany şişe garşy immun jogabyny güýçlendirmek üçin alternatiw strategiýalary açyp biler.
Näsaglaryň nusgalary we kliniki maglumatlary Kanadanyň Dokumalaryň Saklaýyş Ulgamy tarapyndan tassyklanan Britaniýa Kolumbiýasynyň rak keseliniň dokumalarynyň ammary arkaly alyndy. Britaniýa Kolumbiýasynyň Rak Barlaglary Etika Komiteti we Britaniýa Kolumbiýa Uniwersiteti (H07-00463) tarapyndan tassyklanan protokola laýyklykda, ähli näsaglaryň nusgalary we kliniki maglumatlary habarly ýazmaça razylyk aldy ýa-da resmi taýdan razylyklaryndan ýüz öwürdi. Nusgalar tassyklanan BioBankda (BRC-00290) saklanýar. Näsagyň jikme-jik häsiýetnamalary S1 we S5 tablisalarynda görkezilen. Kriokonserwasiýa üçin, näsagyň şiş nusgasyny mehaniki taýdan parçalamak we soňra ony 100 mikronly süzgüçden geçirmek üçin skalpel ulanylýar we bir öýjükli suspenziýa alýar. Näsagyň assitleri öýjükleri bölmek we üstki gatlagy aýyrmak üçin 4°C-de 10 minutlap 1500 aýlaw/minut tizlikde santrifuga edildi. Şişden we assitden alnan öýjükler 50% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen adam AB syworotkasynda (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) we 10% dimetil sulfoksidde kriokonserwasiýa edildi. Bu konserwirlenen ýeke öýjükli suspenziýalar eredildi we aşakda beýan edilen metabolomika we metabolitleri kesgitlemek üçin ulanyldy.
Doly gurşaw 0,22 μm süzülen 50:50 goşmaça RPMI 1640: AimV-den ybarat. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 10% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen adam AB syworotkasy (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penisilin Streptomisin (PenStrep) ergini (Thermo Fisher Scientific) we 50 μMB-merkaptoetanol bilen goşmaça. AimV (Invitrogen) 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) we 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) bilen goşmaça berilýär. Akym sitometriniň reňkleýji buferi 3% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen AB adam syworotkasy (Sigma) bilen goşmaça 0,22 μm süzülen fosfat buferleşdirilen duzly erginden (PBS; Invitrogen) ybaratdy. Öýjük baýlaşdyryjy bufer 0,22μm süzülen PBS-den ybarat we 0,5% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen adam AB syworotkasy (Sigma-Aldrich) bilen doldurylýar.
37°C doly gurşawda öýjükler 10 nM MT DR we 100 μM 2-NBDG bilen 30 minutlap boýaldy. Soňra öýjükler 4°C-de 15 minutlap ýaşaýyş ukybyna eýe eF506 boýag bilen boýaldy. Öýjükleri FC Block (eBioscience) we Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)-de gaýtadan suspenziýa ediň, akym sitometri boýag buferinde suwuklandyryň (önümlendirijiniň görkezmelerine laýyklykda) we otagyň temperaturasynda 10 minutlap inkubasiýa ediň. Öýjükleri antitela toplumy (S2 tablisa) bilen 4°C-de 20 minutlap akym sitometri boýag buferinde boýaň. Analizden öň öýjükleri akym sitometri boýag buferinde (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurasiýa) gaýtadan suspenziýa ediň. Öýjük sany maglumatlaryny seljermek üçin SpectroFlo we FlowJo V10 ulanyň we maglumatlary döretmek üçin GraphPad Prism 8 ulanyň. 2-NBDG we MT DR-iň ortaça fluoresensiýa intensiwligi (MFI) log-normalaşdyryldy, soňra gabat gelýän näsaglary hasaba almak üçin statistik seljerme üçin jübütlenen t test ulanyldy. Seljermeden 40 wakadan az bolan ähli populýasiýalary aýyryň; statistik seljerme we maglumatlary görselleşdirmezden öň, islendik negatiw gymmatlyklar üçin 1 MFI gymmatyny giriziň.
Ýokardaky proses paneliniň el bilen giriş strategiýasynyň üstüni ýetirmek üçin, FlowJo-da öli öýjükleri aýyrandan soň öýjükleri awtomatiki usulda populýasiýa bellemek üçin şekil çäklendirme agajynyň (FAUST) (21) doly düşündirişini ulandyk. Nädogry ýerleşdirilen ýaly görünýän (PD1+-y PD1-şiş öýjükleri bilen birleşdirýän) we saklanan populýasiýalary birleşdirmek üçin çykyşy el bilen dolandyrýarys. Her bir nusgada ortaça 2% -den gowrak öýjük bar, jemi 11 populýasiýa.
PBMC-ni leýkositleri bölmek önümlerinden (STEMCELL Technologies) aýyrmak üçin Ficoll gradient dykyzlyk santrifugasy ulanyldy. CD8 + T öýjükleri PBMC-den CD8 MicroBeads (Miltenyi) ulanylyp bölünip alyndy we öndürijiň görkezmelerine laýyklykda 2 hepde TransAct (Miltenyi) ulanylyp doly gurşawda giňeldildi. Öýjükler IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) saklaýan doly gurşawda 5 gün duraldy we soňra TransAct bilen gaýtadan stimullaşdyryldy. 7-nji günde, öndürijiň görkezmelerine laýyklykda, öýjükleri yzly-yzyna üç tapgyrda baýlaşdyrmak üçin adam CD45 MicroBeads (Miltenyi) ulanyldy. Öýjükler akym sitometriýasynyň derňewi üçin (ýokarda beýan edilişi ýaly) bölündi we LC-MS/MS seljermesi üçin bir million öýjük üç gezek bölündi. Nusgalar aşakda beýan edilişi ýaly LC-MS/MS arkaly işlenildi. Ýiten metabolitiň gymmatyny 1000 ion sany bilen kesgitledik. Her bir nusga umumy ion sany (TIC) bilen normallaşdyrylýar, logarifmik öwrülýär we analizden öň MetaboAnalystR-de awtomatiki usulda normallaşdyrylýar.
Her bir hassanyň ýeke öýjükli suspenziýasy eredilip, 40 μm süzgüçden geçirip doly gurşawa süzüldi (ýokarda beýan edilişi ýaly). Öndürijiniň protokolyna laýyklykda, CD8+, CD4+ we CD45- öýjükleri üçin nusgalary (buzda) baýlaşdyrmak üçin MicroBeads (Miltenyi) ulanyp magnit monjuklary bölmek arkaly üç yzygiderli pozitiw saýlama tapgyry ulanyldy. Gysgaça aýdylanda, öýjükler öýjük baýlaşdyrmak buferinde gaýtadan suspenziýa edilýär (ýokarda beýan edilişi ýaly) we sanalýar. Öýjükler adam CD8 monjuklary, adam CD4 monjuklary ýa-da adam CD45 monjuklary (Miltenyi) bilen 4°C-de 15 minutlap inkubasiýa edildi we soňra öýjük baýlaşdyrmak buferi bilen ýuwuldy. Nusga LS sütüninden (Miltenyi) geçirilýär we pozitiw we negatiw fraksiýalar ýygnalýar. Öýjükleriň dikeldilmeginiň dowamlylygyny azaltmak we iň ýokary derejä çykarmak üçin, CD8-fraksiýasy soňra CD4+ baýlaşdyrmagyň ikinji tapgyry üçin ulanylýar we CD4-fraksiýasy soňraky CD45 baýlaşdyrmak üçin ulanylýar. Bölmek prosesiniň dowamynda ergini buzda saklaň.
Metabolit analizine nusgalary taýýarlamak üçin öýjükler buz ýaly sowuk duz ergini bilen bir gezek ýuwuldy we her nusga 1 ml 80% metanol goşuldy, soňra worked edildi we suwuk azotda doňduryldy. Nusgalar üç gezek doňdurma-ereme sikline sezewar edildi we 4°C-de 15 minutlap 14,000 aýlaw/minut tizlikde santrifuga edildi. Metabolitleri öz içine alýan üstki gatlak guraýança bugarylýar. Metabolitler 50 μl 0,03% formik kislotada gaýtadan eredildi, garyşdyrmak üçin worked edildi we soňra galyndylary aýyrmak üçin santrifuga edildi.
Metabolitleri ýokarda beýan edilişi ýaly çykaryň. Metabolomika barlaglary üçin üstki gatlagy ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýa çüýşesine geçiriň. Toplu täsirleriň öňüni almak üçin her bir nusgany meňzeş sanly öýjükler bilen bejermek üçin tötänleýin bejeriş protokolyny ulanyň. Biz öň AB SCIEX QTRAP 5500 Üçlü Kwadrupol Mass Spektrometrinde (50) çap edilen global metabolitleriň hil taýdan bahalandyrmasyny geçirdik. Hromatografik analiz we pik meýdanynyň integrasiýasy MultiQuant wersiýasynyň 2.1 programma üpjünçiligini (Applied Biosystems SCIEX) ulanyp geçirildi.
Ýiten metabolit gymmatyny kesgitlemek üçin 1000 ion sany ulanyldy we her bir nusganyň TIC-i nusga işlemesinden instrumental analiz arkaly girizilen üýtgeşmeleri düzetmek üçin her bir anyklanan metabolitiň normallaşdyrylan pik meýdanyny hasaplamak üçin ulanyldy. TIC normallaşdyrylandan soň, logarifmik konwersiýa we awtomatiki norma çyzygynyň ölçeglendirilmegi üçin MetaboAnalystR(51) (standart parametr) ulanylýar. Biz nusga görnüşleriniň arasyndaky metabolom tapawutlarynyň gözleg analizini geçirmek üçin wegan R bukjasy bilen PCA ulandyk we hassalary analiz etmek üçin bölekleýin artykmaçlyk analizini ulandyk. Nusgalaryň arasyndaky Ýewklid aralygyny klasterleşdirmek üçin ýylylyk kartasynyň dendrogrammasyny gurmak üçin Ward usulyny ulanyň. Bütin öýjük görnüşi we mikro gurşaw boýunça dürli derejede köp metabolitleri kesgitlemek üçin standartlaşdyrylan metabolit mukdarynda limma (52) ulandyk. Düşündirişi ýönekeýleşdirmek üçin, modeli kesgitlemek üçin toparyň ortaça parametrini ulanýarys we mikro gurşawdaky öýjük görnüşlerini her topar hökmünde göz öňünde tutýarys (n = 6 topar); Ähmiýetlilik synagy üçin her metabolit üçin üç gezek gaýtalanýan ölçeg geçirdik. Ýalňyş replikasiýadan gaça durmak üçin, hassa limma dizaýnynda päsgelçilik hökmünde goşuldy. Dürli hassalaryň arasyndaky metabolitleriň tapawudyny barlamak üçin, hassalary öz içine alýan limma modelini kesgitlenen usulda düzeddik. Öýjük görnüşi bilen Padj <0.05 mikro gurşawynyň arasyndaky öňünden kesgitlenen kontrastyň ähmiýetini habar berýäris (Benjamini-Hochberg düzedişi).
Miltenyi Ölü Öýjük Aýyrmak Kit (>80% ýaşaýyş ukyby) ulanyp güýç baýlaşdyrylandan soň, umumy doňdurylan assitlerde we şiş nusgalarynda 10x 5'gen ekspresiýa protokolyny ulanyp, bir öýjükli transkriptom yzygiderliligi geçirildi. Bir şiş nusgasyndan alnan pes ýaşaýyş ukyby onuň goşulmagyna päsgel berse-de, gabat gelýän şişler we assitler bolan bäş ýagdaý seljerildi. Näsaglaryň köp sanly saýlanmagyna ýetmek üçin, her bir näsagyň nusgalaryny 10x hrom kontrolleriniň zolaklarynda birleşdirdik we assitleri we şiş ýerlerini aýratynlykda seljerdik. Yzygiderlikden soň [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp jübütli uç (PE), Kwebek genom; şiş we assit üçin her öýjük üçin ortaça 73,488 we 41,378 okamak]], biz CellSNP we Vireo (53) ulandyk (CellSNP esasynda GRCh38 tarapyndan berlen umumy adam SNP (VCF) donor şahsyýetine berilýär. Biz hassanyň genotip ýagdaýynyň (IBS) iň ýakyn şahsyýetini (IBS) kesgitlemek üçin SNPRelate ulanýarys, bellenilmedik öýjükleri we dupleks hökmünde kesgitlenen öýjükleri we assit bilen şiş nusgalarynyň arasyndaky donorlary deňeşdirýän öýjükleri aýyrýarys (54). Bu wezipäniň esasynda, aşaky akymda analiz üçin şişde we assitde köp öýjük görkezilişi bolan üç ýagdaýy sakladyk. Scater (55) we scran (56) BioConductor gaplamasynda köpçülikleýin süzgüçleme ädimini ýerine ýetirenden soň, analiz üçin 6975 öýjük (şişden we assitden degişlilikde 2792 we 4183 öýjük) aldyk. Biz Jaccard aralygyna esaslanyp, umumy iň ýakyn goňşy torunyň (SNN) igraph-yň (57) Louvain klasterleşdirmesini ulanýarys. ekspressiýa boýunça klaster öýjükleri. Klasterler marker gen ekspressiýasyna esaslanyp, çaklanylýan öýjük görnüşlerine el bilen bellik edildi we t-SNE bilen wizuallaşdyryldy. Sitotoksik T öýjükleri CD8A we GZMA ekspressiýasy bilen kesgitlenýär, ribosomal belogyň ekspressiýasy pes bolan kiçi klasterleri hasaba almaýarys. Biz Izar we beýlekileriň çap edilen maglumatlaryna (16), şol sanda olaryň t-SNE ýerleşdirilişine, immun öýjük markerleri bilen NNMT ekspressiýasynyň arasyndaky ekspressiýanyň gabat gelmegini gözegçilikde saklap bilýäris.
PBMC-ler leýkositleri bölmek önümlerinden (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient dykyzlyk santrifugasiýasy arkaly bölünip alyndy. CD3 + öýjükleri PBMC-den CD3 munçuklary (Miltenyi) ulanylyp bölünip alyndy. MNA-nyň bar ýa-da ýoklugynda, CD3 + öýjükleri plastinka bilen baglanyşykly CD3 (5μg/ml), ereýän CD28 (3μg/ml) we IL-2 (300 U/ml; Proleukin) bilen aktiwleşdirildi. Giňelmegiň soňky gününde, ýaşaýyş ukyby (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) we köpelme (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) akym sitometriýasy arkaly bahalandyryldy. GolgiStop bilen 4 sagatlap PMA (20 ng/ml) we ionomisin (1μg/ml) bilen öýjükleri höweslendirmek arkaly effektor funksiýasyny bahalandyryň we CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) we TNFα-fluoressein izotiosiyanat (FITC) (MAb11, BD) gözegçilik ediň. 4 sagatlap qPCR we ChIP öýjüklerini PMA (20 ng/ml) we ionomisin (1μg/ml) bilen höweslendiriň. ELISA üstki gatlagy 4 sagatlap PMA (20 ng/ml) we ionomisin (1 μg/ml) bilen höweslendirmeden öň we soň ýygnaldy.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ulanyp RNK-ny bölüp almak üçin öndürijiň protokolyna eýeriň. Nusgany gomogenleşdirmek üçin QIAshredder (QIAGEN) ulanyň. Komplementar DNK-ny (cDNA) sintezlemek üçin ýokary kuwwatly RNK-ny kDNK-a öwürmek üçin kit (Thermo Fisher Scientific) ulanyň. Gen ekspresiýasyny (önümlendirijiniň protokolyna laýyklykda) aşakdaky zondlar bilen ölçemek üçin TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ulanyň: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseraldehyde-3-fosfat off wodorod (GAPDH)] we Hs01010726_m1 (SLC22A2). Nusgalar MicroAmp optiki plyonkaly MicroAmp çalt optiki 96 guýulyk reaksiýa plastinkasynda (Applied Biosystems) StepOnePlus real wagt PCR ulgamynda (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) işledildi. 35-den geçýän islendik Ct bahasy anyklaýyş çäginden ýokary hasaplanýar we anyklanmaýan diýlip bellenilýär.
Öň beýan edilişi ýaly (58) ChIP-i ýerine ýetiriň. Gysgaça aýdylanda, öýjükler formaldegid bilen işlenildi (soňky konsentrasiýa 1.42%) we otag temperaturasynda 10 minutlap inkubasiýa edildi. Goşmaça şişme buferini (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl we 0.1% NP-40) buzda 10 minutlap ulanyň, soňra beýan edilişi ýaly (58) immunopresipitasiýa buferinde gaýtadan suspenziýa ediň. Soňra nusga aşakdaky sikller bilen ultrases bilen işlenip düzüldi: 10 sikl (20 1 sekuntlyk impulslar) we 40 sekuntlyk statik wagt. ChIP derejeli immunoglobulin G (Öýjük Signal Tehnologiýasy; 1μl), giston H3 (Öýjük Signal Tehnologiýasy; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) we SP1 (Öýjük Signal Tehnologiýasy; 3μl) antitelalaryny nusga bilen 4°CC temperaturada gijesine çaýkaň. A proteini munçuklaryny (Thermo Fisher Scientific) nusga bilen 4°C-da 1 sagatlap ýuwaşlyk bilen çaýkap inkubasiýa ediň, soňra DNK-ny baýlaşdyrmak üçin heleks munçuklaryny (Bio-Rad) ulanyň we proteinaza K-ny (Thermo Fisher) belogy siňdirmek üçin ulanyň. TNFα promotory PCR arkaly anyklandy: öňe, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; tersine, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp önüm). Suratlar Image Lab (Bio-Rad) tarapyndan öndürildi we ImageJ programma üpjünçiligi arkaly mukdary kesgitlendi.
Öýjük medeniýetiniň üstki gatlagy ýokarda beýan edilişi ýaly ýygnaldy. Kesgitleme öndüriji tarapyndan adam TNFα ELISA toplumy (Invitrogen), adam IL-2 ELISA toplumy (Invitrogen) we adam IFN-γ ELISA toplumy (Abcam) boýunça proseduralara laýyklykda geçirildi. Öndürijiniň protokolyna laýyklykda, üstki gatlak TNFα we IL-2-ni anyklamak üçin 1:100, IFN-γ-ni anyklamak üçin bolsa 1:3 gatnaşygynda suwuklandyryldy. 450 nm-de absorbsiýany ölçemek üçin EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ulanyň.
PBMC leýkositleri bölmek önümlerinden (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient dykyzlyk santrifugasiýasy arkaly bölünip alyndy. CD3 + öýjükleri PBMC-den CD3 munçuklary (Miltenyi) ulanylyp bölünip alyndy. MNA-nyň bar ýa-da ýoklugynda, CD3 + öýjükleri plastinka bilen baglanyşykly CD3 (5μg/ml), ereýän CD28 (3μg/ml) we IL-2 (300 U/ml; Proleukin) bilen 3 günläp aktiwleşdirildi. 3 günden soň, öýjükler ýygnaldy we 0.9% duzly ergin bilen ýuwuldy we granula doňduryldy. Öýjükleriň sany 123 sanly eBeads ulanyp, akym sitometriýasy (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurasiýa) arkaly geçirildi.
Ýokarda beýan edilişi ýaly metabolitleri çykaryň. Guradylan ekstrakt 4000 öýjük ekwiwalenti/μl konsentrasiýasynda gaýtadan dikeldildi. Nusgany tersine fazaly hromatografiýa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) we CORTECS T3 sütüni (2.1 × 150 mm, bölejikleriň ululygy 1.6-μm, gözenekleriň ululygy 120-Å; #186008500, Waters) arkaly seljeriň. Polýar massa spektrometri (6470, Agilent), onda elektropreý ionizasiýa oňyn režimde işleýär. Hereketli A fazasy 0.1% formik kislotadan (H2O-da), hereketli B fazasy 90% asetonitrilden, 0.1% formik kislotadan ybarat. LC gradienti 100% A üçin 0-dan 2 minuta çenli, 99% B üçin 2-den 7.1 minuta çenli we 99% B üçin 7.1-den 8 minuta çenli. Soňra sütüni 3 minutlap 0.6 ml/min akym tizliginde hereketli A fazasy bilen gaýtadan deňleşdiriň. Akym tizligi 0.4 ml/min we sütüniň kamerasy 50°C-a çenli gyzdyrylýar. Saklama wagtyny (RT) we özgerişi (RT = 0.882 minut, 1-nji özgeriş = 137→94.1, 2-nji özgeriş = 137→92, 3-nji özgeriş = 137→78) kesgitlemek üçin MNA-nyň arassa himiki standartyny (M320995, Toronto Research Chemical Company, Demirgazyk Ýork, Ontario, Kanada) ulanyň. Üç geçişiň hemmesi dogry saklanma wagtynda bolanda, anyklygy üpjün etmek üçin 1-nji geçiş ulanylýar. MNA-nyň (Toronto Research Chemical Company) standart egrisi, degişlilikde 0,1, 1,0, 10 we 100 ng/ml we 1,0 we 10μg/ml suwuklyk standartlaryny almak üçin esasy erginiň (1 mg/ml) alty yzygiderli suwuklandyrylmagy arkaly döredildi. Anyklaýyş çägi 1 ng/ml, çyzykly jogap bolsa 10 ng/ml bilen 10μg/ml aralygyndadyr. LC/MS analizi üçin iki mikrolitr nusga we standartyň her inýeksiýasy ulanylýar we analiz platformasynyň durnuklylygyny üpjün etmek üçin her sekiz inýeksiýada garyşyk hil gözegçiligi nusgasy geçirilýär. MNA bilen işlenen ähli öýjük nusgalarynyň MNA jogaplary synagyň çyzykly aralygynda boldy. Maglumat analizi MassHunter mukdary seljeriş programma üpjünçiligi (v9.0, Agilent) ulanylyp geçirildi.
Ikinji nesil αFR-CAR gurluşy Song we beýlekilerden alyndy (59). Gysgaça aýdylanda, gurluş aşakdaky mazmuny öz içine alýar: CD8a lider yzygiderligi, adamyň αFR-a mahsus ýeke zynjyrly üýtgeýän bölegi, CD8a menteşe we transmembran sebit, CD27 öýjük içi domeni we CD3z öýjük içi domeni. Doly CAR yzygiderligi GenScript arkaly sintez edildi we soňra transduksiýanyň netijeliligini bahalandyrmak üçin ulanylýan GFP ekspresiýa kassetasynyň ýokarsyndaky ikinji nesil lentiwirus ekspresiýa wektoryna klonlaşdyryldy.
Lentiwirus HEK293T öýjükleriniň transfeksiýasy arkaly öndürilýär [Amerikan görnüşli medeniýet kolleksiýasy (ATCC); Dulbekkonyň 10% fetal syworotka (FBS) we 1% PenStrep saklaýan üýtgedilen Eagle gurşawynda ösdürilip ýetişdirilýär we CAR-GFP wektory ulanylýar we gaplama plazmidleri (psPAX2 we pMD2.G, Addgene) lipofeksiýon aminini (Sigma-Aldrich) ulanýar. Wirus saklaýan üstki gatlak transfeksiýadan 48 we 72 sagat soň ýygnaldy, süzüldi we ultrasentrifugasiýa arkaly konsentrlendi. Konsentrlenen wirus üstki gatlagyny transduksiýa bolýança -80°C temperaturada saklaň.
PBMC sagdyn donor leýkosit bölmek önümlerinden (STEMCELL Technologies) Ficoll gradient dykyzlyk santrifugasiýasy arkaly bölünýär. CD8+ öýjüklerini PBMC-den bölüp almak üçin oňyn saýlama CD8 mikrobunjalaryny (Miltenyi) ulanyň. T öýjüklerini TransAct (Miltenyi) we TexMACS gurşawynda [Miltenyi; 3% ýylylyk bilen inaktiwleşdirilen adam syworotkasy, 1% PenStrep we IL-2 (300 U/ml) bilen goşulan] stimulirläň. Stimulirlemeden ýigrimi dört sagat soň, T öýjükleri lentivirus bilen (106 öýjük üçin 10 μl konsentrirlenen wirus supernatanty) transduksiýa edildi. Cytek Aurora-da transduksiýadan 1-3 gün soň (FSC (Öňe saçramak)/SSC (Gapdal saçramak), Singlet, GFP+-da), iň az 30% transduksiýa netijeliligini görkezmek üçin öýjükleriň GFP ekspresiýasyny bahalaň.
CAR-T öýjükleri Immunocult-da (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep bilen goşulan) 24 sagatlap aşakdaky şertlerde ösdürilip ýetişdirildi: işlenilmedik, 250 μM adenozin ýa-da 10 mM MNA bilen işlenildi. Öňünden bejergiden soň, CAR-T öýjükleri PBS bilen ýuwuldy we 10-da 10% FBS we 1% PenStrep bilen goşulan 20,000 SK-OV-3 öýjükleri [ATCC; McCoy 5A gurşawynda (Sigma-Aldrich): 1-iň effektor-nyşa gatnaşygy goşulan Immunocult gurşawynda üç esse köpeldildi. Digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) bilen lizislenen SK-OV-3 öýjükleri we SK-OV-3 öýjükleri degişlilikde negatiw we oňyn gözegçilik hökmünde ulanyldy. Bilelikde ösdürilip ýetişdirilenden 24 sagat soň, üstki gatlak ýygnaldy we laktatdegidrogenaza (LDH) öndürijiň görkezmelerine (LDH Glo Sitotoksiklik Analiz Toplumy, Promega) laýyklykda ölçeldi. LDH üstki gatlagy LDH buferinde 1:50 garyndysynda suwuklandyryldy. Öldüriliş göterimi aşakdaky formula arkaly ölçeldi: öldüriliş göterimi = düzediş göterimi / iň ýokary öldüriliş tizligi x 100%, bu ýerde düzediş göterimi = diňe bilelikde ösdürilip ýetişdirilen T öýjükleri we iň ýokary öldüriliş tizligi = oňyn gözegçilik-negatiw gözegçilik.
Tekstde ýa-da materiallarda we usullarda beýan edilişi ýaly, statistik seljerme üçin GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ýa-da R v3.6.0 ulanyň. Eger bir hassadan birnäçe nusga ýygnalsa (meselem, assit we şiş), biz jübüt t synagyny ulanýarys ýa-da hassany degişli ýagdaýda çyzykly ýa-da umumylaşdyrylan modelde tötänleýin täsir hökmünde goşýarys. Metabolomika derňewi üçin möhümlik synagy üç esse geçirilýär.
Bu makala üçin goşmaça materiallar üçin http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 salgysyna serediň.
Bu Creative Commons Attribution-Non-Commercial License şertlerine laýyklykda ýaýradylýan açyk girişli makala bolup, ol islendik serişdede ulanmaga, ýaýratmaga we köpeltmäge rugsat berýär, eger soňky ulanyş täjirçilik girdejisi üçin bolmasa we asyl işiň dogrudygy şerti bilen. Salgylanma.
Bellik: Sahypa maslahat berýän adamyň e-poçtany görmegini isleýändigiňizi we onuň spam däldigini bilmegi üçin diňe e-poçta salgyňyzy bermegiňizi haýyş edýäris. Biz hiç hili e-poçta salgylaryny hasaba almarys.
Bu sorag siziň myhmandygyňyzy barlamak we awtomatiki spam iberilmeginiň öňüni almak üçin ulanylýar.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MakFerson (Sarah MakFerson), Lauren G. Zakaria (Lauren G. Zakarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Jon Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis) (Ralph J. DeBerardinis)
MNA T öýjükleriniň immun basyşyna goşant goşýar we adam rak keselini bejermek üçin mümkin bolan immunoterapiýa nyşanyny aňladýar.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MakFerson (Sarah MakFerson), Lauren G. Zakaria (Lauren G. Zakarias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Jon Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis) (Ralph J. DeBerardinis)
MNA T öýjükleriniň immun basyşyna goşant goşýar we adam rak keselini bejermek üçin mümkin bolan immunoterapiýa nyşanyny aňladýar.
© 2021 Ylmyň ösüşi üçin Amerikan birleşigi. ähli hukuklar goralandyr. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef we COUNTER-iň hyzmatdaşy. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.