Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS üçin çäkli goldaw bar. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de utgaşyklylyk režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, goldawy dowam etdirmegi üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Oňurgaly haýwanlardan tapawutlylykda, mör-möjeklerde erkek taraply jyns steroid gormonlarynyň ýetmezçiligi giňden ýaýran hasaplanýar. Anopheles gambiae-de ekdizon steroidi 20-gidroksiekdizon (20E) dişiler tarapyndan sintez edilende ýumurtga ösüşini gözegçilikde saklamak we erkekler tarapyndan jyns taýdan geçirilende jübütlenmegiň refrakter döwrüni döretmek üçin ösen ýaly görünýär3. Ýumurtga ösüşi we jübütlenmek möhüm köpeliş aýratynlyklary bolany üçin, dişi Anopheles çybynlarynyň bu gormon signallaryny nähili birleşdirýändigini düşünmek täze bezge garşy göreş maksatnamalaryny işläp düzmäge ýardam edip biler. Bu ýerde biz bu köpeliş funksiýalarynyň ekdisteroidi aktiwleşdirýän/inaktiwleşdirýän fermentleriň çylşyrymly ulgamy arkaly aýry-aýry jyns steroidleri tarapyndan düzgünleşdirilýändigini açyp görkezýäris. Biz jynsy geçişden soň aýallaryň jyns kabul edijiligini öçürmek we defosforilleşme arkaly aktiwleşdirmek arkaly ene-atany goraýan erkeklere mahsus oksidlenen ekdizon, 3-dehidro-20E (3D20E) anykladyk. Belli bir zat, 3D20E geçişi Plazmodium infeksiýasy wagtynda ýumurtga ösüşini saklaýan we ýokançly aýallaryň saglygyny üpjün edýän köpeliş genleriniň ekspresiýasyny hem döretdi. Aýallardan alynýan 20E şeýle edýär jynsy reaksiýa döretmeýär, ýöne 20E-iň öňüni alýan kinazalar basylyp alnandan soň jübütleşýän şahslaryň ýumurtga goýmagyna mümkinçilik berýär. Bu erkeklere mahsus mör-möjek steroid gormonynyň we onuň aýallaryň jynsy kabul edijiligini, döllenmegini we Plazmodium bilen özara täsirini düzgünleşdirmekdäki rolynyň anyklanmagy, bezgek ýaýradyjy çybynlaryň köpeliş üstünligini peseltmegiň mümkinçiligini görkezýär.
Adam bezgek parazitleriniň ýeke-täk wektory bolan Anopheles çybynlarynda insektisidlere garşylyk giňden ýaýranlygy sebäpli bezgek hadysalary we ölümler ýene-de artýar4. Bu çybynlaryň jübütleşme biologiýasy täze bezgeklere garşy göreş çäreleri üçin aýratyn özüne çekiji nyşandyr, sebäbi dişiler diňe bir gezek jübütleşýärler5; bu ýeke-täk jübütleşme hadysasyny sterilleşdirmek meýdandaky çybynlaryň sanyny azaltmaga uly mümkinçilik berer.
Aýallar erkeklerden ýokary titrli steroid gormonlaryny alandan soň jynsy taýdan ejizleşýärler. Barlaglar mundan beýläk jübütleşmekde kynçylygyň döremeginiň sebäbiniň liçinka tapgyrynda tüýtmek sikliniň düzgünleşdirijisi hökmünde has köp tanalýan steroid gormony bolan 20-gidroksiekdizon (20E) bolandygyny görkezdi. Erkekleriň 20E-ni sintezlemek we geçirmek ukyby, Afrikada ýaýran we Anopheles gambiae ýaly bezgegiň iň howply wektorlaryny öz içine alýan Cellia7 kiçi urugynyň bir bölegi bolan Anopheles görnüşlerinde, aýratyn hem ösdi. Bu aýratyn üns berilmeli zat, sebäbi bu görnüşlerde urkaçylar her gan iýmitinden soň 20E öndürýärler we 20E oogenez siklini herekete getirýär (8-nji salgylanma serediň). Şeýle-de bolsa, urkaçylaryň öz jübütleşmek ukybyna zyýan ýetirmezden ekdizonyň iki dürli çeşmesinden (erkekleriň geçişi we gan iýmitlendirme induksiýasy) signallary nähili birleşdirýändigi barada az zat mälim. Aslynda, urkaçylar tarapyndan öndürilen 20E jynsy çydamsyzlygy döretse, bu çybynlarda örän ýaýran hereket bolan bakylyk iýmitlendirýän adamlarda dölsüzlige getirer5.
Mümkin bolan düşündiriş, A. gambiae erkekleriniň modifisirlenen erkeklere mahsus ekdizony geçirýändigi, bu bolsa aýallaryň köpeliş ýolunda signal beriş kaskadyny işjeňleşdirýändigi we jübütleşmekde durnuksyzlyga getirýändigidir. Şeýle-de bolsa, oňurgaly haýwanlarda estrogen we androgen ýaly köp sanly steroid gormonlary bar bolsa-da (9-njy salgyda gözden geçirildi), biziň bilşimiz ýaly, böceklerde androgenlere esaslanýan steroidler anyklanmady.
Biz mümkin bolan modifisirlenen steroidleri gözlemek üçin jynsy taýdan ýetişen A. gambiae-niň erkek erkek goşmaça bezindäki (MAG) steroid gormonlarynyň repertuaryny kesgitlemäge girişdik. Öň ulanylan has az anyk usulyň ýerine, ýokary netijeli suwuklyk hromatografiýasyny tandem massa spektrometriýasy (HPLC-MS/MS) bilen utgaşdyryp, bu dokumada ekdizon (E) we 20E-ni anykladyk, bu bolsa öňki netijäni tassyklady. Şeýle-de bolsa, nusgada 3-degidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 formulasyna laýyk gelýän oksidlenen fosforlaşdyrylan steroidler agdyklyk edýärdi (1-nji surat). Beýleki görnüşlere 3-degidro-20E (3D20E) we 20E-22-fosfat (20E22P) girýär. 3D20E22P-niň HPLC-MS/MS signalynyň intensiwligi onuň defosforlaşdyrylan görnüşi bolan 3D20E-den iki esse ýokary we E we 20E-den üç esse ýokarydy (1-nji surat). Emma beýleki böleklerinde beden we aşaky reproduktiw ýollar (LRT; Giňeldilen maglumatlar 1a-njy surat). Şeýle hem, täze ýapylan (<1 günlük) erkeklerde we aýallarda ekdisteroidleri seljerdik we diňe MAG-da 3D20E we 3D20E22P-ni anykladyk; E, 20E we 20E22P iki jynsda hem bardy (Giňeldilen maglumatlar 1b-nji surat). Bu maglumatlar A. gambiae ululykdaky erkekleriniň MAG-larynda aýallar tarapyndan sintezlenmeýän ýokary titrli modifisirlenen gormonlary öndürýändigini görkezýär.
MAG we aýal LRT (atria, tohum köpüjikleri we parowarium bilen birlikde) 4 günlük (4 günlük) gyz ​​erkeklerden we gyz we jübütlenen aýallardan (0,5, 3 we 12 hpm) bölünip alyndy. Bu dokumalardaky ekdizon HPLC-MS/MS arkaly seljerildi (ortaça ± sem; jübütlenmedik t-test, iki taraply, ýalňyş açyş tizligi (FDR) düzedildi; NS, ähmiýetli däl; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 sagat 0,5 sagata garşy, P = 0,035; 12 sagat 3 sagata garşy, P = 0,0015; 12 sagat 0,5 sagata garşy, P = 0,030. 3D20E22P: 3 sagat 0,5 sagata garşy, P = 0,25; 12 sagat 3 sagata garşy, P = 0.0032; 12 sagat 0.5 sagada garşy, P = 0.015). Maglumatlar üç biologik gaýtalamadan alyndy. Gyzyklanylýan her bir ekdizon üçin iň ýokary meýdan hasaplandy we çybynlaryň sany bilen normallaşdyryldy. Ekdizon aşakdaky reňk bilen görkezilýär: E, ýaşyl; 20E, mämişi; 20E22P, gyrmyzy; 3D20E, gök; 3D20E22P, gülgüne. Goýlan surat ekdizon derejesiniň pesdigini görkezmek üçin y okunyň ölçegini artdyrýar.
3D20E22P we 3D20E-niň jübütleşme wagtynda geçirilýändigini ýa-da geçirilmeýändigini öwrenmek üçin, jübütleşmeden soňky dürli wagt nokatlarynda dişi LRT-leri kesdik. Ekdizon gyzlarda tapylmasa-da, jübütleşmeden derrew soň (jübütleşmeden 0,5 sagat soň, hpm) LRT-de ep-esli mukdarda 3D20E22P-niň bardygyny, wagtyň geçmegi bilen azalýandygyny, 3D20E derejesiniň bolsa ep-esli ýokarlanandygyny gördük (1-nji surat). Himiki taýdan sintezlenen 3D20E-ni standart hökmünde ulanyp, jübütleşme LRT-lerinde bu steroid gormonynyň derejesiniň 20E-den azyndan 100 esse ýokarydygyny anykladyk (Giňeldilen maglumatlar tablisa 1). Şeýlelik bilen, 3D20E22P jübütleşme wagtynda dişi LRT-e geçirilýän esasy erkek ekdizondyr we onuň defosforlaşdyrylan görnüşi, 3D20E, jübütleşmeden gysga wagt soň örän köp bolýar. Bu bolsa, soňky ekdisonyň dişi jübütleşmeden soňky biologiýasynda möhüm rol oýnaýandygyny görkezýär.
Täze RNK yzygiderlik (RNK-seq) maglumatlar toplumyny döredenden soň (2a-njy surat), ýörite gurlan bioinformatika turba geçirijisini ulanyp, ekdizon kinazasyny (EcK), ekdizon oksidazasyny (EO) we 20E-modifikasiýa edilen fosfataza genini kodlaýan ekdizony gözledik. EPP) reproduktiw dokumalarda ekspressiýa edilýär. Bir dalaşgär EPP genini we iki potensial EcK genini (EcK1 we EcK2) anykladyk, ýöne gowy dalaşgär EO genini tapyp bilmedik. Belli bir zat, aýratyn EPP genleri Gambiýa MAG-larynda ýokary derejede (98.9-njy persentil) ekspressiýa edildi, ýöne aýal LRT-lerinde däldi (2b-nji surat), bu biziň garaşýanlarymyzyň tersine, sebäbi bu aýal dokumasynda 3D20E22P-niň defosforilleşmesi boldy. Şonuň üçin erkek EPP-niň jübütleşme wagtynda geçirilmegine ynanýarys. Hakykatdan-da, jübütleşmeden soň aýal belogyny maskalamak üçin in vivo durnukly izotop etiketkasyny ulandyk, bu ferment aýal atriumynda MS tarapyndan anyklanyldy (Şekil 1). 2c we Goşmaça 1-nji tablisa). MAG-da we jübütlenen (ýöne gyz däl) aýal LRT-de EPP-niň bardygy hem belli bir antitelalaryň kömegi bilen tassyklanyldy (2d-nji surat).
a, Her jynsyň köpeliş dokumalarynda EcK, EO we EPP kodlaýan genleri gözlemek üçin ýörite gurlan bioinformatika turbageçirijisi. Oklaryň ýanyndaky sanlar her ädimde erkek we aýal dalaşgärleriň sanyny görkezýär. Bu analiz erkeklerde ekspressiýa edilýän bir EPP geni (EPP) we bir EcK geni (EcK1), şeýle hem iki jynsyň hem ekspressiýa edilýän, ýöne dalaşgär EO geni bermeýän bir EcK geni (EcK2) anyklady.b, Gyzlyk (V) we jübütlenýän (M) Anopheles gambiae we Anopheles albicans dokumalarynda dalaşgär gen ekspressiýasyny deňeşdirýän ýylylyk kartasy. Spca, tohumlandyrma; MAGs, erkeklerde goşmaça bezler; bedeniň beýleki bölekleri, şol sanda iki jynsda hem döşler, ganatlar, aýaklar, ýag bedenleri we içki organlar, şeýle hem aýallarda ýumurtgalyklar. EcK2 Gambiýanyň MAG we atriumlarynda ýokary derejede beýan edilýär, EPP bolsa diňe MAG-da duş gelýär.c, erkekleriň ejakulýasiýa toparynyň aýal atriumlaryna 3, 12 we 24 at güýjünde geçişiniň proteomiki analizi, iň köp duş gelýän 67 belok görkezýär. Aýallar ähli beloklary belliklemek (we maskalamak) üçin 15N öz içine alýan iýmit bilen ösdürildi. Belliksiz erkekler bellikli aýallar bilen jübütleşdirildi we aýal LRT-leri proteomiki analiz üçin 3, 12 we 24 at güýjünde bölünip alyndy (ejakulýasiýa beloklarynyň doly sanawy üçin Goşmaça 1-nji tablisa serediň). EPP, Eck1 we EcK2 gyz erkekleriň MAG-da bu dokumalaryň proteomiki analizi arkaly anyklandy.d, EPP jübütlenen aýallaryň MAG we LRT-de günbatar blot arkaly anyklandy, ýöne gyz aýallarda ýa-da erkeklerde ýa-da aýalyň galan böleginde anyklanmady. beden. Membranlar bir wagtyň özünde anti-aktin (ýükleme gözegçiligi) we anti-EPP antitelalary bilen barlandy. Ähli erkekler gyzdyr. Gel çeşmeleri baradaky maglumatlar üçin Goşmaça 1-nji surata serediň. Western blotlar iki gezek geçirildi we meňzeş netijeler berildi.
EPP-niň ekdisteroid fosfofosfataza işjeňligi MAG-dan bölünip alnan 3D20E22P bilen HPLC-MS/MS arkaly inkubasiýa edilenden soň tassyklanyldy (Giňeldilen maglumatlar 2a-njy surat). Mundan başga-da, RNK arkaly interferensiýa (RNKi) arkaly EPP-ni susduranymyzda, bu erkekleriň köpeliş dokumalarynda fosfataza işjeňliginiň güýçli peselendigini anykladyk (3a-njy surat) we EPP bilen susdurylan erkekler bilen jübütleşdirilen urkaçylar genleriň bölekleýin susdurylmagyna garamazdan, defosforlaşdyrylan 3D20E-niň A paýynyň ep-esli pesdigini görkezdiler (3b-nji surat). Tersine, şol bir çybynlarda 20E22P/20E gatnaşygynda ep-esli üýtgeşmeleri anyklamadyk, bu bolsa fermentiň 3D20E22P üçin spesifikdigini görkezýär (3b-nji surat).
a, Iki zynjyrly EPP RNK (dsEPP) ýa-da iki zynjyrly GFP RNK (dsGFP) kontrollaryny ulanyp EPP-niň susdurylmagy sebäpli MAG-da fosfataza işjeňliginiň peselmegi. Her gaýtalamada ýigrimi MAG howzy ulanyldy (P = 0.0046, jübütlenen t-test, iki taraply), aýry nokatlar bilen görkezilýär. b, EPP-niň susdurylmagy bilen erkege jübütlenen urkaçylarda 3 at güýjünde defosforlaşdyrylan 3D20E-niň paýy has pesdi (P = 0.0043, jübütlenmedik t-test, iki taraply), şol bir wagtyň özünde 20E derejelerine täsir edilmedi (P = 0.063, jübütlenmedik). t-test, iki taraply). Maglumatlar her biri 13, 16 we 19 dişiden ybarat üç topardan ortaça ± sem hökmünde görkezilýär.c, EPP-den dymdyrylan erkekler bilen jübütleşdirilen dişileriň gaýtadan jübütleşme derejesi has ýokary boldy (P = 0.0002, Fişeriň takyk synagy, iki taraply). Dişiler ilki jübütleşmek ýagdaýyny üpjün etmek üçin jübütleşmäge mejbur edildi; 2 günden soň, olar transgen sperma göterýän beýleki erkekler bilen aragatnaşyk saklap, transgeniň mukdary boýunça PCR arkaly gaýtadan jübütleşme tizligini baha berdiler. EPP bilen dymdyrylan erkekler bilen jübütleşdirilen gan bilen iýmitlenen dişileriň döllenme ukyby ep-esli peseldi (P < 0.0001; Mann-Whitney synagy, iki taraply) we ýumurtga sany birneme azaldy (P = 0.088, Mann-Whitney synagy, iki taraply), şol bir wagtyň özünde ýumurtgalama tizligine täsir edilmedi (P = 0.94, Fişeriň takyk synagy, iki taraply). Ähli panellerde n biologik taýdan garaşsyz çybyn nusgalarynyň sanyny görkezýär. NS, ähmiýetli däl.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Soňra, biz ekdizon defosforlaşmasynyň aýallarda jübütlenmäge garşylygy döretmek üçin möhümdigini ýa-da möhüm däldigini baha berdik. EPP-den mahrum erkekler bilen jübütlenen aýallar goşmaça (transgen) erkekler bilen ýüzbe-ýüz bolanda, gözegçilik toparyna (10,4%) garanyňda has ýokary ýygylykda (44,9%) gaýtadan jübütlendiler (3c-nji surat). Şeýle hem, biz dogurmagyň ep-esli azalandygyny (3d-nji surat, çepde) we bu aýallar tarapyndan goýlan ýumurtgalaryň sanynyň birneme azalandygyny (3d-nji surat, ortada) synladyk, şol bir wagtyň özünde aýallar tarapyndan goýlan ýumurtgalaryň göterimine (jybütlenmek arkaly aýallarda ýüze çykýan başga bir jogap) täsir edilmedi (3d-nji surat, sagda). 3D20E22P üçin EPP-niň synlanan spesifikligini göz öňünde tutup, bu netijeler jübütlenmek wagtynda geçirilen EPP tarapyndan 3D20E-niň aktiwleşdirilmeginiň aýallaryň mundan beýläk jübütlenmäge kabul edijiligini öçürmekde möhüm rol oýnap biljekdigini görkezýär, bu hereket öň 20E-niň jynsy geçişine baglydy. Şonuň üçin bu erkeklere mahsus gormon aýallaryň dogurmagyna hem güýçli täsir edýär.
Soňra, himiki usulda sintezlenen 3D20E (4a–c surat) we satuwda elýeterli 20E ulanyp, jynsy taýdan ýetişen gyzlarda inýeksiýa tejribelerinde 20E we 3D20E-niň işjeňligini deňeşdirdik. Iki konsentrasiýada hem (4d surat) zenanlaryň jübütlenmäge duýgurlygyny öçürmekde 3D20E-niň 20E-den has täsirlidigini gördük. Belli bir zat, LRT-däki 3D20E-niň fiziologik derejesiniň ýarysy (inýeksiýadan soň 1066 pg we jübütlenmekden soň 2022 pg) iň ýokary konsentrasiýada, ýagny jübütlenmekden soň 18 pg-da, inýeksiýadan 24 sagat soň 20E-niň fiziologik derejesinden (inýeksiýadan soň 361 pg) 20 esse ýokary bolan refrakter zenanlaryň paýyny döretdi; Giňeldilen Maglumatlar Tablisasy 1). Bu netije 20E-niň jynsy geçişiniň jübütleşme refrakter döwürlerine sebäp bolmaýandygy baradaky pikir bilen gabat gelýär we 3D20E-niň ene-çaga gatnaşyklaryny üpjün etmekde esasy faktor hökmünde görkezilýändigini görkezýär. 3D20E, şeýle hem, gyz zenanlarda ýumurtga goýmak synaglarynda 20E-den has işjeň boldy (4e surat), bu bolsa EPP-niň bölekleýin dymdyrylmagyndan soň synlan adaty ýumurtga goýmak tizliginiň jübütleşme arkaly döredilen zenan faktorlary tarapyndan henizem öndürilýän galan 3D20E işjeňliginiň bolmagy bilen baglanyşyklydygyny görkezýär.
(a,b) 20E-den himiki taýdan sintezlenen 3D20E (a) örän ýokary konwersiýa/netijelilik bilen (maglumatlar üç garaşsyz sintez reaksiýasyndan ortaça ± sem hökmünde görkezilýär) (b).c, Massa spektri (aşaky ýarym) jübütlenen aýal LRT-de (ýokarky ýarym).d tapylan ekdizon bilen doly gabat gelýär, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fişeriň takyk synagy, iki taraply) we 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fişeriň takyk synagy, 2 taraply) bilen deňeşdirilende, 20E bolsa diňe ýokary dozalarda (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fişeriň takyk synagy, 2 taraply).e bilen deňeşdirilende, 3D20E inýeksiýasy gyz dişilerde 10% etanol gözegçilik toparyna garanyňda has ýokary ýumurtga çykaryş tizligine sebäp boldy (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fişeriň takyk synagy, iki taraply), gözegçilik toparyna garanyňda bolsa 20E diňe ýokary dozalarda (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fişeriň takyk synagy, iki taraply). 3D20E ýokary dozalarda 20E-den has ýokary ýumurtga çykaryş tizligine sebäp boldy (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fişeriň takyk synagy, iki taraply). Ähli panellerde n biologik taýdan garaşsyz çybyn nusgalarynyň sanyny görkezýär. NS, ähmiýetli däl.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Maglumatlar üç gaýtalanmadan alynýar.
Öňki gözleglerde biz steroid gormonlarynyň jynsy taýdan geçirilmeginiň A. gambiae zenanlaryny P. falciparum infeksiýasyndan goraýan zenan reproduktiw geni bolan MISO-nyň (Oogeneziň jübütlenmegi bilen baglanyşykly stimulyatory 11) ekspresiýasyny döredýändigini anykladyk. Bu gen iň howply adam bezgek paraziti bolan 13-iň sebäp bolýan saglyk çykdajylarydyr. MISO-nyň bezgek ýaýran sebitlerde Anopheles-iň reproduktiw sagdynlygy üçin ähmiýetini göz öňünde tutup, bu geniň ekspresiýasyny haýsy 3D20E ýa-da 20E gormonynyň işjeňleşdirýändigini anyklamak kararyna geldik. 20E inýeksiýasynyň HR3 we HR4 ýaly käbir ýadro gormon reseptorlaryny (HR) we Vg14, 15, 16 ýaly adaty aşaky akym steroid nyşanalaryny aýratyn ýa-da has güýçli induksiýa edendigini anykladyk, MISO-nyň 3D20E tarapyndan has güýçli induksiýa edilendigini anykladyk (Giňeldilen maglumatlar 3-nji surat). Şeýlelik bilen, bu androgen steroid gormonynyň jynsy taýdan geçirilmegi zenanlary parazit infeksiýasynyň döredýän çykdajylaryndan goraýan mehanizmleri döredýän ýaly. Mundan başga-da, 3D20E iki izoforma hem dürli täsir edýär. E reseptory EcR-iň, EcR-A-ny induksiýa edýän we EcR-B-ni basyp ýatyrýan, şeýle hem aýallaryň göwreliligine täsir edýän HPX15 ýaly beýleki jübütlenmegi induksiýa edýän genleri has güýçli işe girizýän E reseptory EcR-iň. Bu, EPP-den dymýan erkekler bilen jübütlenen aýallarda syn edilýän möhüm göwreliligi düşündirip biler (Giňeldilen maglumatlar 3-nji surat). Bu maglumatlar jyns aýratynlygynyň esasynda ýatan iki ekdizon gormony tarapyndan artykmaçlyk bilen işjeňleşdirilýän aşaky akym ýollarynyň bardygyny görkezýär.
Soňra, bioinformatika turbageçirijimizde anyklanan iki EcK geniniň funksiýasyny synagdan geçirdik. EcK1 ýa-da EcK2-niň öçürilmegi erkeklerde uly ölüme getirdi (Giňeldilen maglumatlar 4a-njy surat), bu bolsa ekdizon fosforlaşmasynyň we şonuň üçin işjeňsizleşdirilmegiň ýaşamak üçin möhümdigini görkezýär. EcK2 EcK1-den ýokary derejede ekspresirlenýändigi we proteomika arkaly MAG-larda anyklanandygy sebäpli (2b,c-nji surat we Goşmaça tablisa 2), biz onuň ekdisteroid kinaz işjeňligini 20E bilen inkubasiýa edip tassykladyk, bu bolsa 20E22P fosforlaşmasyna getirdi (Giňeldilen maglumatlar 2-nji surat).4b). 3D20E-ni substrat hökmünde ulananda, fosforlaşan önüm 3D20E22P-ni anyklap bilmedik (Giňeldilen maglumatlar 4c-nji surat), bu bolsa 3D20E-niň ýerine 20E-niň EcK2-niň iň gowy nyşany bolup biljekdigini görkezýär.
RNK-sequence analizimize görä, EcK2 gyz zenanlaryň LRT-sinde hem ýokary derejede ekspresirlendi, ol ýerde jübütlenenden soň ol ​​öçürildi (2b-nji surat). Biz bu maglumatlary tassykladyk we EcK2 ekspresiýasynyň gan bilen iýmitlenmegiň täsirine düşmedigini anykladyk (Giňeldilen maglumatlar 5a-njy surat). Ilkinji MS tejribelerimizi giňeldip, 20E22P-niň iň ýokary derejesiniň 20E-niň iň ýokary derejesi bilen ýakyn baglanyşyklydygyny anykladyk (gan bilen iýmitlenenden 22-26 sagat soň; Giňeldilen maglumatlar 5b-nji surat). Gyz zenanlarda EcK2-niň öçürilmegi gan bilen iýmitlenenden 26 sagat soň 20E-niň 20E22P-e bolan gatnaşygynyň 3 esse ýokarlanmagyna getirdi (Giňeldilen maglumatlar 2c we 5c suratlary), bu bolsa EcK2-niň zenanlarda hem 20E-ni fosforlaşdyrýandygyny tassyklaýar. Esasan hem, EcK2-den mahrum gyz zenanlar doly jynsy kabul edijiligini sakladylar (Giňeldilen maglumatlar 5d, e suratlary), bu bolsa zenanlarda 20E-niň öndürilmeginiň jübütlenmäge sebäp bolmaýandygyny görkezýär. refrakter döwürler. Şeýle-de bolsa, bu dişileriň ýumurtga goýuş tizligi gözegçilik toparyna garanyňda ep-esli ýokarlandy, gyzlaryň 30% -den gowragy ýumurtga goýdy (Giňeldilen maglumatlar 5f-nji surat). Eger iki zynjyrly Eck2 RNK (dsEcK2) inýeksiýalary gan iýmitinden soň ýerine ýetirilse, ýumurtga dökülme bolmady, şol wagtda gan iýilmegi sebäpli 20E pik derejesi peseldi. Umuman, bu netijeler gan sorujydan soň öndüren 20E-niň ýumurtga dökülmegine sebäp bolup biljekdigini, ýöne diňe ýumurtga dökülme blokadasy (EcK2 we mümkin başga faktorlar) jübütleşme arkaly öçürilende ýüze çykandygyny görkezýän modeli goldaýar. 20E-de, 3D20E-de inýeksiýalar gyzlarda EcK2 ekspresiýasynyň öňüni almady (Giňeldilen maglumatlar 5g-nji surat), bu bolsa başga faktorlaryň bu kinazanyň öňüni almagyna sebäp bolýandygyny görkezýär. Şeýle-de bolsa, gan iýmitinden soň 20E derejesi jübütleşme rahatsyzlygyny döretmek üçin ýeterlik däldi, ýöne jynsy taýdan geçýän 3D20E-niň ýokary titrleri bilen netijeli ýagdaýda ýüze çykdy.
Netijelerimiz A. gambiae-niň köpeliş üstünligini düzgünleşdirýän mehanizmler barada möhüm düşünje berýär. Erkekleriň erkeklere mahsus üýtgedilen ekdizon bolan 3D20E-niň ýokary titrlerini sintezlemek üçin ösen model peýda boldy, bu bolsa zenanlaryň has köp jübütlenmäge duýgurlygyny azaltmak arkaly ene-ata bolmagyny üpjün edýär. Şol bir wagtyň özünde, bu bezgek wektorlary erkeklere mahsus EPP-niň jynsy geçişine jogap hökmünde zenanlarda 3D20E-ni işjeňleşdirmek üçin netijeli ulgam döretdiler. Bilşimiz ýaly, bu böceklerde özboluşly we möhüm funksiýany ýerine ýetirýän erkek we zenan agdyklyk edýän steroid gormon ulgamynyň ilkinji mysalydyr. Erkeklere mahsus ekdizon funksiýasy öňe sürüldi, ýöne anyk görkezilmedi. Mysal üçin, köp babatda inkär edilýän gipoteza 18, bu funksiýalaryň 20E öňbaşçysy E1 tarapyndan ýerine ýetirilip bilinjekdigidir. Drosophilada monandriýanyň kiçi jyns peptidleriniň jyns geçişi bilen başlanýandygy mälimdir19,20, olar zenanlaryň köpeliş ýoluny aýratyn jyns peptid reseptorlary arkaly innerwirleýän neýronlar bilen özara täsirleşýär21,22. Kesgitlemek üçin goşmaça iş gerek A. gambiae urkaçylarynda 3D20E tarapyndan dolandyrylýan aşaky akym signallaşdyryş kaskadlary we bu kaskadlaryň çybynlar bilen Drosophila arasynda saklanyp galyp biljekdigini ýa-da saklanyp bilmejekdigini kesgitlemek.
3D20E-niň zenanlaryň göwreliligine we özüni alyp barşyna möhüm roly göz öňünde tutulanda, 3D20E sintezine we aktiwleşdirilmegine alyp barýan ýollar geljekki çybynlara garşy göreş strategiýalary üçin täze mümkinçilikleri hödürleýär, mysal üçin steril mör-möjek tehnologiýa strategiýalarynda bäsdeşlikli steril erkekleriň döremegi. Ýabany goýbermek üçin ýa-da 3D20E-ni gyzlyk oýnunda gaýtalamak üçin ulanyň. 3D20E-niň erkeklere mahsus funksiýasy A. gambiae we beýleki Cellia görnüşleri öz spermalaryny jübütleşmek üçin tıkaçlara koagulýasiýa etmek ukybyny alanda ösen bolmagy mümkin, sebäbi bu köp sanly gormonlaryň we gormonlary aktiwleşdirýän fermentleriň netijeli geçirilmegine mümkinçilik berýär. Öz gezeginde, monandriýany amala aşyrýan 3D20E ewolýusiýasy zenanlaryň (MISO-nyň ýokary ekspresiýasy arkaly) gyzlaryň malariýanyň ýokary ýaýran ýerlerinde reproduktiw taýýarlygyny goldamak üçin mehanizm döredýär, bu bolsa gytaklaýyn Plazmodiumyň geçirilmegine goşant goşýar. Zenan 20E-niň zenan Anopheles çybynlarynda P. falciparum-yň ýaşamagyna we ösüşine çuňňur täsir edýändigi görkezilendigini göz öňünde tutup,24 erkek we zenan steroid gormon ýollary häzir çybyn-parazit özara täsirleriniň esasy taraplarydyr.
A. gambiae G3 ştammlary standart mör-möjek şertlerinde (26-28 °C, 65-80% otnositel çyglylyk, 12:12 sagat ýagtylyk/garaňky fotoperiodyň dowamynda) ösdürilip ýetişdirildi. Liçinkalar tozan balyk iýmiti bilen (TetraMin Tropiki Örümçekler, Koi Granulalary we Tetra Hovuz Taýajyklary 7:7:2 gatnaşygynda) iýmitlendirildi. Uly ýaşly çybynlara ad libitum 10% dekstroza ergini we hepdede adam gany berildi (gan böleklerini öwreniň). Gyz çybynlar uçlaryny mikroskopiýa arkaly barlandan soň, jynslary pupa tapgyrynda bölmek arkaly alyndy. DsRed transgenini göterýän erkekler öň beýan edildi.
Mejbury jübütleşmek tejribeleri öň beýan edilen protokollara laýyklykda geçirildi. Tebigy jübütleşmek üçin 4 günlük gyz dişiler iki gije jynsy taýdan ýetişen gyz erkekler bilen 1:3 gatnaşykda saklandy. Erkeklere dsEPP sanjym edilen tejribeler üçin bilelikde torlara salmak sanjymdan soňky 3-4-nji günlere gabat geldi, bu gün fosfataza işjeňligi iň ýokary derejede öçürildi (Giňeldilen maglumatlar 2b-nji surat).
Çybyn dokumalary, galan jesetler (bedeniň galan bölegi) ýa-da tutuş beden 100% metanola bölünip, munjuk bilen gomogenleşdirildi (2 mm aýna munjuklar, 2400 aýlanma/minut, 90 sek). Dokumalaryň mukdary we metanolyň göwrümi aşakdaky ýaly boldy: bedeniň galan bölegi, 1000 µl-de 50; MAG, 50–100 80 µl; zenan LRT, 25–50 80 µl. Çökündi şol bir möçberdäki metanol bilen ikinji metanol ekstraksiýasyna sezewar edildi. Öýjük galyndylary santrifugalamak arkaly aýryldy. Iki ekstraksiýadan alnan metanol birleşdirilip, azot akymynyň aşagynda guradyldy, soňra suwda 80% metanolyň aşakdaky möçberlerinde gaýtadan suspenzasiýa edildi: bedeniň galan bölegi, 50 µl; MAG we zenan LRT, 30 µl.
Nusgalar LC guralyna (Vanquish, Thermo Fisher) birikdirilen massa spektrometrinde (ID-X, Thermo Fisher) seljerildi. 25 °C-de saklanýan 3 µm, 100 × 4.6 mm sütüne (Inspire C8, Dikma) 5 µl nusga sançyldy. LC üçin hereketli fazalar A (suw, 0.1% formik kislota) we B (asetonitril, 0.1% formik kislota) boldy. LC gradienti aşakdaky ýaly boldy: 1 minut üçin 5% B, soňra 11 minutda 100% B-a çenli ýokarlandyryldy. 100% -de 8 minutdan soň, sütüni 5% B-de 4 minutlap gaýtadan deňleşdiriň. Akym tizligi 0.3 ml min-1 boldy. MS çeşmesinde ionlaşma oňyn we negatiw režimlerde gyzdyrylan elektropreý ionlaşmasy arkaly amala aşyrylýar.
Mass-spektrometr m/z aralygyndaky maglumatlary doly MS re modeiminde 60,000 çözgütde 350-den 680-e çenli ölçeýär. MS/MS maglumatlary [M + H]+ (ähli nyşanalar), [M - H2O + H]+ (ähli nyşanalar) we [M - H]- (fosforlaşdyrylan nyşanalar) boýunça alyndy. MS/MS maglumatlary hiç hili standarty bolmadyk nyşanalaryň ekdizon häsiýetlerini tassyklamak üçin ulanyldy. Maksatly däl ekdisteroidleri kesgitlemek üçin, >15% deňeşdirme mukdary bolan ähli HPLC depeleri üçin MS/MS maglumatlary seljerildi. Bir belli nusganyň (ähli beýleki nyşanalar) absolýut mukdaryny ýa-da suwuklandyrmalaryny hasaplamak üçin arassa standartlardan (20E, 3D20E) döredilen standart egrileri ulanyp, olaryň bir erkekde tapylan mukdaryna deňdigini hasaplaň. 3D20E üçin, aşakdaky goşulmalaryň jemini ulanyp, mukdary kesgitleme geçirildi: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Maglumatlar Tracefinder (wersiýa 4.1) ulanyp çykaryldy we mukdary kesgitlendi. MS/MS maglumatlary Xcalibur (wersiýa 4.4) ulanyp seljerildi. E, 20E we 3D20E-niň MS spektrleri degişli standartlar bilen deňeşdirildi. 3D20E22P Girard reaktiwi bilen deriwatizasiýa arkaly seljerildi. 20E22P m/z gatnaşygy arkaly seljerildi.
3D20E22P MAG-dan arassalandy. Arassalamak HPLC-MS/MS analizi bilen birmeňzeş LC şertlerinde dört polly massa esasly detektor (QDa, Acquity, Waters) bilen ultra öndürijilikli suwuk hromatograf (Acquity, Waters) ulanyp analitik ölçegde geçirildi. Öň kesgitlenen ýaly saklanyş wagtynda 3D20E22P-e laýyk gelýän m/z anyklananda, bölek ýygnamak başlandy. Soňra çykarylan birleşmeleriň arassalygy ýokarda beýan edilişi ýaly HPLC-MS/MS arkaly barlandy.
Jemi RNK önüm öndürijiň görkezmelerine laýyklykda TRI reagentini (Thermo Fisher) ulanyp 10-12 reproduktiw dokumalardan ýa-da bedeniň beýleki böleklerinden (başsyz) alyndy. RNK TURBO DNase (Thermo Fisher) bilen işlenildi. kDNK önüm öndürijiň görkezmelerine laýyklykda Moloney syçan leýkemiýa wirusy ters transkriptazasyny (M-MLV RT; Thermo Fisher) ulanyp sintez edildi. Ters transkripsiýa üçin primerler (RT-qPCR; Giňeldilen Maglumatlar Tablisasy 2) öň çap edildi24 ýa-da Primer-BLAST26 ulanyp dizaýn edildi, ölçegi 70-150 bp bolan we ekzon-ekzon birikmelerini ýa-da Primer jübüt primerlerini aýry ekzonlara artykmaçlyk berildi. Üç-dört biologik gaýtalanmalardan kDNK nusgalary RT-qPCR üçin suwda dört esse suwlandyryldy. Mukdar kesgitlemesi 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerleri we 5 µl suwlandyrylan kDNK-ny öz içine alýan 15 µl gaýtalanma reaksiýalarynda geçirildi. Reaksiýalar bir QuantStudio 6 Pro real wagt PCR ulgamy (Thermo Fisher) we maglumatlar Dizaýn we Analiz (2.4.3 wersiýasy) arkaly ýygnaldy we seljerildi. Bu gözlegde görkezilişi ýaly, deňeşdirilen möçberler ribosomal gen RpL19 (AGAP004422) bilen normallaşdyryldy, onuň ekspresiýasy gan bilen iýmitlenmek 27 ýa-da jübütleşme 3 bilen düýpli üýtgemedi.
RNK hili Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ulanylyp barlandy. Illumina jübütlenen uç kitaphanalary MIT-iň Broad institutynda we Garwardda taýýarlanyldy we işledildi. Yzygiderli okamalar HISAT2 (wersiýa 2.0.5) ulanyp, standart parametrler bilen A. gambiae genomyna (PEST ştammy, 4.12 wersiýasy) deňleşdirildi. Kartalaşdyryş hili (MAPQ) ballary <30 bolan okamalar Samtools (wersiýa 1.3.1) ulanylyp aýryldy. Genlere kartalaşdyrylan okamalaryň sany standart parametrler bilen htseq-count (wersiýa 0.9.1) ulanylyp sanaldy. Normallaşdyrylan okama sany hasaplandy we R-de (wersiýa 4.0.3) DESeq2 bukjasyny (wersiýa 1.28.1) ulanyp differensial gen ekspresiýasy seljerildi.
Ekdizon modifikasiýa edýän gen kandidatlary ilki bilen A. gambiae genomyny PSI-BLAST algoritmini (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ulanyp gözlemek arkaly anyklandy. Parametrler aşakdaky sorag belok yzygiderlikleri bilen: Bombyx mori-den (Goşulma № NP_001038956.1), Musca domestica-dan (Goşulma № XP_005182020.1, XP_005175332.1 we XP_011294434.1) we Microplitis demolitor-dan (Goşulma № XP_008552646.1 we XP_008552645.1), B. mori-den EcK (Goşulma № NP_001036900), Drosophila melanogaster-den (Goşulma № NP_651202), Apis mellifera (Goşulma № XP_394838) we Acyrthosiphon pisum (Goşulma № XP_001947166); we B. mori-den EPP (Goşulma № XP_001947166) NP_001177919.1 we NP_001243996.1) we D. melanogaster-iň EO-sy (Goşulma № NP_572986.1) (1-nji ädim). Soňra, Gambiýada reproduktiw dokumada (aýal LRT ýa-da MAG) ýokary mRNA ekspresiýasyna (million kartalaşdyrylan okalyşa >100 bölek/kilobaza ekzony (FPKM) ýa-da >85%) esaslanyp, süzgüç urgulary geçirilýär (2-nji ädim). Spesifikligi ýokarlandyrmak üçin, biz jübütleşme wagtynda ekdizony sintezlemeýän ýa-da geçirmeýän anofel görnüşi bolan A. albimanusyň köpeliş dokumasynda hem ekspressiýa edilýän kandidat fermentleri saýladyk. Kandidat genleri A. albimanus köpeliş dokumasynda pes ekspressiýa (<100 FPKM ýa-da <85-nji persentil) esasynda süzüldi (3-nji ädim). Soňky süzgüç hökmünde (4-nji ädim), kandidat genler aşakdakylaryň azyndan birini kanagatlandyrmaly: (1) dürli ekspressiýa edilen genleriň seljermesine görä jübütleşmeden soň ep-esli ýokarlanan (P < 0,05) we (2) köpeliş däl dokumalarda (< 85 % ýa-da <100 FPKM).
Biz tutuş organizmiň izotopiki etiketkasyny gazanmak üçin öň beýan edilen 28,29,30 usullary üýtgetdik. Gysgaça aýdylanda, ýabany görnüşli Saccharomyces cerevisiae II görnüşli (YSC2, Sigma) azotyň ýeke-täk çeşmesi hökmünde (wt/v) 2% glýukoza (G7528, Sigma), 1,7% aminokislotasyz we ammonium sulfatyny öz içine alýan aşhana azot esasly (BD Difco, DF0335) we 5% 15N ammonium sulfaty (NLM-713, >99%, Kembrij izotop laboratoriýalary) synagdan geçirildi. Aşhana santrifuga arkaly alyndy we çybyn liçinkalary pupasiýa bolýança erkin iýmitlendirildi. Dördünji ýaşdaky ölümiň öňüni almak üçin balyk uny bilen goşmaça berildi (300 liçinka üçin 0,5 mg). Soňra diňe dişiler etiketkasyz erkekler bilen jübütleşme synaglarynda jübütleşme wagtynda geçirilen erkek proteomy seljermek üçin ulanyldy.
4-6 günlük 15N belgili gyz dişiler ýaşy deňleşdirilen, belgilenmedik gyz erkekler bilen jübütleşmäge mejbur edildi. Üstünlikli jübütleşme epifluoresensiýa mikroskopiýasynda jübütleşme tıkaçlaryny tapmak arkaly tassyklanyldy. 3, 12 we 24 at/min tizlikde 45-55 jübütlenen dişileriň atriýasy 50 µl ammonium bikarbonat buferine (pH 7.8) bölünip, pestle bilen gomogenleşdirildi. Gomogenat santrifuga edildi we üstki gatlak 50 mM ammonium bikarbonatdaky 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) bilen garyşdyryldy. Her nusgadaky üstki gatlak we granula gurak buzda doňduryldy we LC-MS/MS üçin nusga taýýarlamak tamamlanan Waşington uniwersitetiniň MacCoss laboratoriýasyna bir gije iberildi. Granulany 50 mM ammoniumdaky 50 µl 0.1% RapiGest-de gaýtadan eridiň. suw wannasynda bikarbonat we sonikat. Pelletiň we üstki gatlagyň belogynyň konsentrasiýasy BCA synagy arkaly ölçeldi, nusgalar 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma) bilen azaldyldy, 15 mM ýodoasetamid (Sigma) bilen alkillendi we 37 °C-da (1:0 50) 1 sagatlap tripsinleşdirme: tripsin: substrat gatnaşygy bilen inkubasiýa edildi. RapiGest 200 mM HCl goşulyp lizis edildi, soňra 37 °C-da 45 minutlap inkubasiýa edildi we galyndylary aýyrmak üçin 4 °C-da 10 minutlap 14,000 aýlaw/minutda santrifuga edildi. Nusgalar iki re modeimli gaty fazaly ekstraksiýa (Oasis MCX kartrijleri, Waters) arkaly ýuwuldy we 0,1% formik kislotada gaýtadan suspenzasiýa edildi, netijede 0,33 µg µl-1 belogyň konsentrasiýasy alyndy. Etiketlenmedik MAG proteomlary hem şeýle usulda arassa tohumdan analiz edildi. erkekler. Her nusga üçin iki analitiki gaýtalama seljerildi. Soňra, her birinden 1 µg, Jupiter C12 tersine fazaly smola (Phenomenex) bilen doldurylan 4 sm erginli kwarts Kasil1 (PQ) frit duzagy we 180 minutlyk suwuk hromatografiýasy bilen 25 sm erginli kwarts 75 μm sütün ulanylyp seljerildi. Nusga digestleri – MS/MS nanoACQUITY UPLC ulgamy (Waters) bilen Q-Exactive HF massa spektrometrinde (Thermo Fisher) işledildi. Her bir iş üçin döredilen maglumatlar bilen baglanyşykly toplama maglumatlary Proteowizard (3.0.20287 wersiýasy) we Comet31 (3.2 wersiýasy) ulanyp, Anopheles gambiae (VectorBase wersiýasy 54), Anopheles coluzzi-den belok yzygiderliklerini öz içine alýan FASTA maglumat bazasyna garşy mzML formatyna geçirildi. Mali-NIH (VectorBase wersiýasy 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021-nji ýylyň marty), A. gambiae RNA-seq we belli adam hapalanmalarynyň üç kadrly terjimelerinde gözleg geçirildi. Peptid kartasyna laýyk gelýän FDR-ler Percolator32 (3.05 wersiýasy) ulanyp 0.01 bosaga bilen kesgitlenildi we peptidler Limelight33-de belok parsimoniýasy arkaly belok identifikasiýalaryna ýygnaldy. (2.2.0 wersiýasy). Beloklaryň deňeşdirilen mukdary öň beýan edilişi ýaly, her tapgyrda her bir belok üçin hasaplanan normallaşdyrylan spektral köplük faktoryny (NSAF) ulanyp kesgitlenildi. Her bir belok bilen deňeşdirilen NSAF iki dürli biologik gaýtalanmalardan alnan nusgalar boýunça ortaça hasaplandy. 15N bellikleme urkaçy proteomy üstünlikli gizledi, ýöne belliklenen gyzlardan az mukdarda belliklenmedik belok ýüze çykarylyp bildi. Biz urkaçy çig nusgalarda erkek belogynyň azalmagynyň (1-5 spektr) diňe tehniki tapgyrlarda, HPLC-niň "geçirilmegi" netijesinde erkek/jynslaşan nusgalaryň yzyndan çig nusgalaryň geçirilendigini hasaba aldyk. Belliklenen gyzlardan "hapalanýan maddalar" hökmünde tapylan wagtal-wagtal beloklar 1-nji goşmaça tablisada görkezilen.
Genscript-de iki antigen peptid, QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipiniň içinde) we MESDGTTPSGDSEQ (PA we PB izotipiniň içinde). Iki peptid birleşdirildi, soňra KLH daşaýjy proteine ​​konýugasiýa edildi we Täze Zelandiýa towşanlaryna sanjym edildi. Towşanlar dördünji sanjymdan soň öldürildi we umumy IgG affinlik arassalaýyş arkaly bölünip alyndy. Iň EPP-spesifik towşandan alnan IgG mundan beýläk-de western-blotlama üçin ulanyldy.
Günbatar blotlar üçin, 4 günlük gyz erkeklerden we gyz ýa-da mejbury jübütlenen dişilerden (<10 jübütlenenden soň) MAG (n = 10, bu ýerde n biologik taýdan garaşsyz çybyn nusgalarynyň sanyny aňladýar) we dişi LRT (n = 30), belok ekstraksiýa buferi (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natriý deoksiholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × proteaza ingibitor kokteýli (Roche)) aýratyn goşuldy. Nusgalar munçuk bilen (2 mm aýna munçuk, 2400 aýlanma/minut, 90 sek) bölünenden soň derrew gomogenleşdirildi. Eremeýän galyndylary 20 000 g-da 4 °C-da santrifugalamak arkaly aýryldy. Beloklar Bradford synagy (Bio-Rad) arkaly sanlandy. Soňra 20 µg MAG belok, 40 µg LRT belok we 20 µg Galyndy köp mukdarly belok MOPS buferi arkaly 10% Bis-Tris NuPAGE bilen denaturasiýa edildi we bölündi. Beloklar iBlot2 geçirijilik ulgamy (Thermo Fisher) arkaly poliwiniliden fluorid membranalaryna geçirildi. Membranalar 1× PBS-T-de iki gezek ýuwuldy (PBS-de 0.1% Tween-20) we soňra Odyssey blokirleýji buferinde (Li-Cor) 22°C-de 1 sagatlap blokirlendi. Membranalar 4°C-de gijesine towşan anti-EPP poliklonal esasy antitela (blokirleýji buferde 1:700) we syçan anti-aktin monoklonal esasy antitela MAC237 (Abeam; 1:4,000) bilen çaýkady. Membranalar PBS-T bilen ýuwuldy we soňra 0.01% SDS we 22 °C-de 1 sagatlap 0,2% Tween -20. Membranalar PBS-T bilen ýuwuldy we Odyssey CLx skaneri bilen suratlandyryldy. Suratlar Image Studio-da ýygnaldy we işlendi (5.2 wersiýasy). EPP-RA izoformasyna (82 kDa) laýyk gelýän belli bir zolak anyklanmady.
EPP-niň kodlaýyş sebitleri (gistidin fosfataza domenini öz içine alýan AGAP002463-RB izoformy hökmünde, NCBI goralan domen gözlegi 34) we EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) plazmidine (Novagen Millipore Sigma) klonlaşdyryldy; praýmerler Giňeldilen Maglumatlar Tablisasy 2-de sanalyp geçilýär. PET-21a(+)-EcK2 gurluşynyň C-terminal 6xHis teginden öň sekiz GS4 baglanyşdyryjysy (tandemde) girizildi. Rekombinant beloklar NEBExpress öýjüksiz E. coli belok sintez reaksiýasy (New England BioLabs) ulanylyp öndürildi. Rekombinant beloklar NEBExpress Ni spin sütunlary (New England BioLabs) ulanylyp arassalandy. Digidrofolat reduktaza (DHFR) gözegçilik belok NEBExpress öýjüksiz E. coli belok sintezi toplumyndan DNK şablony ulanylyp öndürildi. Beloklar PBS-de 50% gliserinde -20 °C temperaturada 3 aýa çenli saklandy.
EPP we dokuma ekstraktlarynyň fosfataza işjeňligi 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich) ulanylyp ölçeldi. Reaksiýa buferinde 25 mM Tris, 50 mM sirke turşusy, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA we 1 mM DTT bardy. Dokumalar reaksiýa buferinde gomogenleşdirildi we öýjük galyndylary santrifuga arkaly aýryldy. 2.5 mg ml-1 pNPP saklaýan reaksiýa buferine ferment ýa-da dokuma ekstraktyny goşmak arkaly reaksiýany başlaň. Reaksiýa garyndysy otagyň temperaturasynda garaňkyda inkubasiýa edildi we pNPP-den öwrülen pNP-niň mukdary dürli wagtlarda 405 nm-de absorbsiýany ölçemek arkaly kesgitlenildi.
In vitro EcK işjeňligi üçin, belok 27°C-da 2 sagatlap 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP we 10 mM MgCl2 saklaýan 200 µl buferde (pH 7.5) 0.2 mg 20E ýa-da 3D20E bilen inkubasiýa edildi. Reaksiýa 800 µl metanol goşmak bilen togtadyldy, soňra -20°C-da 1 sagatlap sowatyldy, soňra 20,000 g-da 4°C-da 10 minutlap santrifuga edildi. Soňra üstki gatlak HPLC-MS/MS arkaly seljerildi. Gözegçilik toparynda ulanylan beloklary gyzdyryp inaktiwleşdirmek üçin, beloklar PBS-de 50% gliserinde 95°C-da 20 minutlap inkubasiýa edildi.
In vitro EPP işjeňligi üçin, belok 25 mM Tris, 50 mM sirke turşusy, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA we 1 mM DTT saklaýan 100 µl buferde (pH 7.5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS bilen arassalanan 18 jübüt MAG-da tapylan mukdaryna deň) bilen 27 °C-da 3 sagatlap inkubasiýa edildi. Reaksiýa 400 µl metanol goşmak bilen togtadyldy we -20 °C-da 1 sagatlap sowatyldy, soňra 20,000 g-da 4 °C-da 10 minutlap santrifuga edildi. Üstki gatlak HPLC-MS/MS bilen seljerildi.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) we EcK2 (556 bp) üçin PZR bölekleri garyşyk jynsly kellesiz çybyn jesetlerinden taýýarlanan kDNK-dan güýçlendirildi. eGFP gözegçiliginiň PZR bölegi (495 bp) öň beýan edilen pCR2.1-eGFP-den güýçlendirildi; PCR praýmerleri Giňeldilen Maglumatlar Tablisasy 2-de görkezilen. PCR bölegi pL4440 plazmidasydaky tersine öwrülen T7 promotorlarynyň arasyna goýuldy. Plazmid gurluşlary NEB 5-α ygtyýarly E. coli-den (Täze Angliýa Biolaboratoriýalary) alyndy we ulanmazdan öň DNK yzygiderliligi bilen tassyklanyldy (goşmaça maglumatlar üçin 1-nji tablisany görüň). T7 promotoryna (Giňeldilen Maglumatlar Tablisasy 2) laýyk gelýän praýmerler pL4440 esasyndaky plazmidasy bolan goşmany güýçlendirmek üçin ulanyldy. PCR önüminiň ölçegi agaroza gel elektroforez arkaly tassyklanyldy. dsRNA Megascript T7 Transkripsiýa Kitini (Thermo Fisher) ulanyp PCR şablonlaryndan transkripsiýa edildi we öndürijiň görkezmelerine laýyklykda öň beýan edilen üýtgetmeler bilen arassalandy.
dsRNA inýeksiýasy üçin, ekloziýadan soň 1 günüň dowamynda ulular erkekleriniň ýa-da aýallaryň (Nanoject III, Drummond) döşüne 10 ng nl-1 konsentrasiýasynda 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) sanjyldy. Genleriň nokdaun derejesi azyndan üç biologik gaýtalanmada RNA ekstraksiýasy, kDNK sintezi we RT-qPCR arkaly kesgitlenildi. Ekdizon inýeksiýasy üçin, 4 günlük gyz ýa-da 6 günlük gyz gan bilen iýmitlenen aýallara synag dizaýnyna baglylykda degişlilikde 1,3, 2,1 konsentrasiýalarynda 0,13, 0,21 ýa-da 0,63 µg 20E ýa-da 3D20E (Nanoject III, Drummond) sanjyldy ýa-da 6,3 ng nl-1 sanjyldy. 10% (göwrüm/göwrüm) 100 nl sanjyň. suwdaky etanol; 10% etanolda 100 nl 3D20E22P (MAG jübütlerinde tapylan mukdaryň 75% -ine deňdir). Çybynlar inýeksiýa toparyna tötänleýin saýlanyldy.
Ýumurtga çykaryş synaglary üçin 3 günlük dişiler adam gany bilen erkin iýmitlendirildi. Bölekleýin iýmitlenen ýa-da iýmitlendirilmedik çybynlary aýyryň. Bejerginiň görnüşine baglylykda, dişiler gan iýiminden soň azyndan 48 sagat dört gije aýry-aýry ýumurtga çykaryş gaplaryna ýerleşdirildi. Ýumurtgalar stereoskop (Stemi 508, Zeiss) astynda sanaldy; jübütlenen dişiler üçin bolsa, liçinkalara öwrülen ýumurtgalar döllenýän hasaplanýardy.
Jübütleşme synaglary üçin, dişileriň jübütlenmäge garşylyk görkezmek üçin bejergi görnüşine baglylykda azyndan 2 gün wagt berildi we ýaşy deň bolan ýabany görnüşli erkekler soňra şol bir gaba ýerleşdirildi. Iki gijeden soň, dişi tohumlanan köpükler bölünip alyndy we genom DNK-sy 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA we 25 mM NaCl (pH 8.2) saklaýan buferde doňdurma-ereme we ultrases arkaly çykaryldy. Nusgalar Proteinaza K (0.86 µg µl-1) bilen 55 °C-da 15 minut, soňra 95 °C-da 10 minut inkubasiýa edildi. Çig genom DNK preparatlary 10 esse suwuklandyryldy we Y hromosoma yzygiderliliginiň qPCR deteksiýasyna sezewar edildi; praýmerler giňeldilen maglumatlar tablisasynyň 2-sinde sanaldy. Y hromosoma yzygiderliliginiň ýoklugy jübütlenmegiň ýokdugyny görkezýär.
Gaýtadan jübütlenmek synaglary üçin, mejbury jübütlenen zenanlaryň jübütlenmek ýagdaýyny tassyklamak üçin jübütlenmek tıkaçlarynyň bardygy barlandy we öň beýan edilişi ýaly 36 erkekleriň ýoklugynda jübütlenmäge garşylykly bolmagy üçin 2 gün wagt berildi. Soňra DsRed transgen spermasyny göterýän erkekler zenan torlaryna girizildi. Iki gijeden soň, zenanlardan döllenýän köpürjikler bölünip alyndy we genom DNK-sy ýokarda beýan edilişi ýaly taýýarlanyldy we DsRed transgeniniň qPCR deteksiýasyna sezewar edildi; praýmerler giňeldilen maglumatlar tablisasynyň 2-nji sahypasynda görkezilen. DsRed transgeniniň ýoklugy gaýtadan jübütlenmegiň bolmandygyny görkezdi.
3D20E öň beýan edilişi ýaly sintez edildi 37 . Gysgaça aýdylanda, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml suwda eredildi, soňra 30 mg platina garasy (toz görnüşinde, Sigma-Aldrich) goşuldy. O2-niň ýumşak akymy reaksiýa garyndysyna yzygiderli köpürjiklendirildi we ol otag temperaturasynda garyşdyryldy. 6 sagatdan soň, reaksiýany duruzmak üçin 30 ml metanol goşuldy. Garyndy katalizator bölejiklerini aýyrmak üçin santrifuga edildi. Üstki gatlak otag temperaturasynda wakuumda guraklyga çenli buglandyryldy. Guradylan reaksiýa önümi HPLC-MS/MS analizi üçin inýeksiýa üçin 10% etanolda we metanolda eredildi. Öwrüliş tizligi (20E-den 3D20E-e çenli) takmynan 97% boldy (4b-nji surat) we sintezlenen 3D20E-niň MS spektri jübütlenen aýallarda tapylan spektre gabat geldi (4c-nji surat).
Legendada geçirilen statistik synaglaryň anyk maglumatlary bar. Fişeriň takyk synagyny, Mantel-Koks synagyny we Studentiň t-testini geçirmek üçin GraphPad (9.0 wersiýasy) ulanyldy. Cochran-Mantel-Haenszel synaglary ýörite R skripti arkaly geçirildi (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test salgysynda elýeterli). Maglumatlaryň paýlanyşy 0.05 ähmiýetlilik çägi bilen Şapiro-Wilk synagyny ulanyp, kadalylyk üçin synagdan geçirildi. Maglumatlar kadalylyk synagyndan geçip bilmedikde, Mann-Whitney synagy geçirildi. Sag galmak maglumatlary Mantel-Koks synagyny ulanyp seljerildi. DESeq2 bukjasy (1.28.1 wersiýasy) RNK-seq gen derejesindäki differensial ekspresiýa analizini geçirmek üçin ulanyldy. Grafikdäki gorizontal çyzyk medianany görkezýär. Ähli synaglar üçin boşluk hökmünde P = 0.05 ähmiýetlilik gymmaty ulanyldy.
Barlag dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin şu makala bilen baglanyşykly Tebigy barlag hasabatynyň gysgaça mazmunyna serediň.
MS proteomik maglumatlary PXD032157 maglumat toplumy identifikatory bilen PRIDE hyzmatdaş ammary (https://www.ebi.ac.uk/pride/) arkaly ProteomeXchange Konsorsiumyna (http://proteomecentral.proteomexchange.org) geçirildi.
RNA-seq maglumatlar toplumy Gen ekspressiýasynyň giňişleýin kitaphanasynda (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 seriýaly ýazgy astynda saklanýar.
Häzirki gözlegiň dowamynda döredilen we/ýa-da seljerilen goşmaça maglumatlar toplumyny degişli awtorlardan zerur isleg boýunça alyp bolýar. Bu makala çeşme maglumatlaryny hödürleýär.
De Loof, A. Ekdisteroidler: Üns berilmeýän mör-möjek jyns steroidleri? Erkek: Gara gutu. Mör-möjek ylmy. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-gidroksiekdizon we Anopheles stephens-de ýumurtgalyklaryň ösüşi. J. Mör-möjek fiziologiýasy.28, 97–109 (1982).