Sekretor ýolda beloklary bölmek öýjük bölümleriniň bölünmegini we gomeostazyny saklamak üçin möhümdir. Gabyk arkaly bölmekden başga-da, kinesinleri bölmekde lipidleriň sekretor daşamak prosesinde roly heniz jogap tapylmadyk uzak wagtlap dowam edýän esasy soragdyr. Bu ýerde biz täze sintezlenen glikosilfosfatidilinozitol-immobilizirlenen beloklaryň örän uzyn keramid lipid bölekleri bolan klasterleşdirilendigini we transmembran beloklary tarapyndan ulanylýandan tapawutly ýöriteleşdirilen endoplazmalaryň Net çykyş ýerine bölünendigini in vivo subut etmek üçin 3D bir wagtyň özünde köp reňkli ýokary çözgütli real wagt suratlaryny ýerine ýetirýäris. Mundan başga-da, biz endoplazmatik retikulum membranasyndaky keramidiň zynjyr uzynlygynyň bu bölmek selektiwligi üçin möhümdigini görkezýäris. Biziň gözlegimiz belok ýüklerini lipid zynjyr uzynlygyna esaslanyp, sekretor ýolda selektiw eksport ýerine bölmek üçin ilkinji göni in vivo subutnamasyny berýär.
Ökariot öýjüklerinde endoplazmatiki retikulumda (ER) sintezlenen beloklar soňra degişli öýjük nokadyna eltip bermek üçin sekretor ýol arkaly daşalanda tertiplenýär (1). Gatlak arkaly tertiplemekden başga-da, käbir lipidleriň belli bir membrana domenlerine toparlanyp, olary belli bir beloklara bölmek arkaly selektiw çykyş nokatlary hökmünde hem hyzmat edip biljekdigi uzak wagtlap çaklanylýardy (2-5). Şeýle-de bolsa, bu mümkin bolan lipid esasly mehanizmi subut etmek üçin in vivo göni subutnamalar henizem ýetmezçilik edýär. Bu esasy meseläni çözmek üçin, biz glikosilfosfatidilinozitol (GPI) bilen baglanyşykly beloklaryň (GPI-AP) ER-den nähili dürli görnüşde eksport edilýändigini drožžilerde öwrendik. GPI-AP-lar lipid bilen baglanyşykly öýjük ýüzündäki beloklaryň dürli görnüşleridir (6, 7). GPI-AP plazma membranasynyň daşky ýapraklaryna glikolipid bölegi (GPI löwheri) arkaly birikdirilen bölünip çykarylan belokdyr. Olar GPI löwherlerini ER boşlugynda konserwatiw post-translýasiýa üýtgeşmeleri hökmünde kabul edýärler (8). GPI-AP Golgi apparatyndan (5, 9) ER-den plazma membranasyna geçýär. GPI ankerleriniň bolmagy GPI-AP-nyň sekresiýa ýoly boýunça transmembran bölünip çykarylan beloklardan (beýleki plazma membrana beloklary bilen birlikde) aýratyn daşalmagyna sebäp bolýar (5, 9, 10). Aşhana öýjüklerinde GPI-AP-lar endoplazmatik retikulumda beýleki bölünip çykarylan beloklardan bölünip alynýar we soňra örtük belok toplumy II (COPII) bilen örtülen özboluşly wezikulalara gaplanýar (6, 7). ER eksport prosesinde bu klassifikasiýa prosesiniň kesgitleýjileri belli däl, ýöne bu mehanizmiň lipidleri, esasanam GPI ankeriniň lipid böleginiň gurluş taýdan täzeden gurulmagyny talap edip biljekdigi çak edilýär (5, 8). Aşhanalarda GPI lipidleriniň täzeden gurulmagy GPI goşulandan derrew başlaýar we köp ýagdaýlarda keramidiň 26-uglerodly uzyn zynjyrly doýgun ýag kislotasyna (C26:0) baglanmagyna sebäp bolýar (11, 12). C26 keramid häzirki wagta çenli drožža öýjükleri tarapyndan öndürilýän esasy keramiddir. Ol ER-de sintez edilýär we onuň köp bölegi COPII wezikulalary arkaly Golgi enjamyna eksport edilýär (13). GPI-AP-nyň ER eksporty, aýratyn hem, dowamly keramid sintezini talap edýär (14, 15) we öz gezeginde, Golgi enjamynda keramidiň inozitol fosfat keramide (IPC) öwrülmegi GPI anker sintezine baglydyr (16). Emeli membranalar bilen biofiziki barlaglar örän uzyn asil zynjyrly keramidleriň özboluşly fiziki häsiýetleri bolan tertipli domenleri emele getirmek üçin birleşip biljekdigini görkezdi (17, 18). Bu maglumatlar C26 keramidiniň we C26 keramid bilen GPI-AP-nyň fiziki häsiýetlerini ulanyp, deňeşdirme boýunça hapa ER membran lipid gurşawynda tertipli sebitlere ýa-da sebitlere birleşýändigi baradaky gipoteza getirýär. Ol esasan gysga we doýmadyk gliserolipidlerden (C16:1 we C18:1) ybarat (19, 20). Bu sebitler aýratyn ER çykyş ýerlerine (ERES) selektiw taýdan gönükdiriler, bu ýerde keramid we keramid esasyndaky GPI-AP şol bir COPII gutjugynda Golgie bilelikde daşalyp bilner (5).
Bu gözlegde biz bu lipid esasly mehanizmi gönüden-göni fluoressentially belgilenen beloklary bir wagtyň özünde synlap bilýän öňdebaryjy mikroskopiýa usuly bolan ýokary çözgütli konfokal real wagtly suratlandyryş mikroskopiýasyny (SCLIM) ulanmak arkaly synagdan geçirdik. Üç reňkli we üç ölçegli (3D) suratlar diri öýjüklerde örän ýokary çözgütlilige we tizlige eýedir (21, 22).
Biz ilki bilen SCLIM tehnologiýasyny ulanyp, S. cerevisiae-de ER-den çykandan soň transmembran bölünip çykan beloklardan C26 keramid topary bolan adaty GPI-AP-nyň nähili barlanandygyny has anykladyk. ER-iň klassifikasiýasyny barlamak üçin, ERES-e in vivo girýän täze sintezlenen ýükleri gönüden-göni görüp bilýän genetiki ulgamy ulandyk (7, 23). Ýük hökmünde, ýaşyl fluorescent belok (GFP) bilen etiketlenen C26 keramid esasly GPI-AP Gas1 we ýakyn infragyzyl fluorescent belok (iRFP) bilen etiketlenen transmembran bölünip çykan Mid2 beloklaryny saýladyk, ikisi hem plazma membranasyny nyşana alýar (24–26). sec31-1 temperatura duýgur mutantynda bu iki ýük galaktoza induksiýa edilýän promotor we konstitutiw ERES markeriniň aşagynda ekspresirlenýär. Ekstremal temperaturada (37°C), sec31-1 mutasiýa COPII örtük komponenti Sec31-iň COPII ösüş we ER eksportynyň öňüni almak funksiýasyna täsir edýändigi sebäpli, täze sintezlenen ýükler ER-de toplanýar (23). Pes temperatura (24°C) çenli sowadylandan soň, sec31-1 mutant öýjükleri bölünip çykarylan ýerden çykdy we toplanan täze sintetiki ýükler ER-den daşary çykarylyp başlady. CLIM wizualizasiýasynda täze sintezlenen Gas1-GFP we Mid2-iRFP-niň köpüsiniň 37°C-de inkubasiýadan soň we soňra 24°C-de 5 minutlap goýberilenden soň hem sec31-1 mutant öýjükleriniň ER-de toplanandygy görkezildi (1-nji surat). Mid2-iRFP tutuş ER membranasynda paýlanandygy we Gas1-GFP-niň üznüksiz ER membrana sebitinde jemlenendigi we ýygnanandygy sebäpli, olaryň paýlanyşy düýbünden başgaça (1-nji surat, A-dan C-a we S1 wideosy). Mundan başga-da, 1D suratda görkezilişi ýaly, Gas1-GFP toplumynda Mid2-iRFP ýok. Bu netijeler GPI-AP we transmembran beloklarynyň irki döwürde dürli ER membrana sebitlerine bölünendigini görkezýär. Gas1-GFP klasteri mCherry-niň COPII örtük belogy Sec13 (1-nji surat, E we F, şeýle hem S1 filmi) bilen belgilenen belli bir ERES-iň golaýynda ýerleşýär (23).
sec31-1 öýjükleri galaktoza sebäpli bölünip çykarylmalary beýan edýär, uzyn asil zynjyry (C26) seramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ýaşyl) we transmembran belogy Mid2-iRFP (TMP, gök) we bu Konstruktiw ERES belligi Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C-da 30 minutlap inkubasiýa edildi, 24°C-a geçirildi we 5 minutdan soň SCLIM arkaly suratlandyryldy. (A-dan C-a çenli) tekizligiň wekilçilikli birleşdirilen ýa-da ýeke 2D şekilini (A), 10 z-bölümiň 2D proýeksiýa şekilini (B) ýa-da ýüküň we ERES markerleriniň 3D öýjük ýarymşar şekilini (C) görkezýär. Ölçeg çyzygy 1μm (A we B). Ölçeg birligi 0.551μm (C). Gas1-GFP aýry ER sebitlerinde ýa-da klasterlerde anyklandy, Mid2-iRFP bolsa ER membranasynyň ähli ýerinde anyklandy we paýlandy (C). (D) Grafik ak ok çyzygy (çepde) boýunça Gas1-GFP klasterinde Gas1-GFP we Mid2-iRFP-niň deňeşdirilen fluoresensiýa intensiwligini görkezýär. AU, islendik birlik. (E we F) harytlaryň we ERES belgisini birleşdirýän 3D şekili görkezýär. Gas1-GFP klasterleri anyk ERES-iň golaýynda ýüze çykaryldy. Ölçeg birligi 0,551μm. (F) Ak reňkli ok ERES bilen baglanyşykly Gas1-GFP klasterini görkezýär. Orta we sag paneller birleşdirilen ulaldylan 3D şekili we saýlanan Gas1-GFP klasteriniň aýlanan görnüşini görkezýär.
Gas1-GFP klasteri bilen belli bir ERES arasyndaky ýakyn giňişlik gatnaşygy Gas1-GFP-niň Mid2-iRFP tarapyndan ER-den çykmak üçin ulanylýan saýlama ukybyndan tapawutlanýan saýlama ERES-e girip biljekdigini görkezýär. Bu mümkinçiligi çözmek üçin, diňe bir ýa-da iki haryt üçin ERES gatnaşygyny sanlaşdyrdyk (2-nji surat, A-dan C-a çenli). ERES-iň köpüsinde (70%) diňe bir görnüşli ýük bardygyny anykladyk. 2C suratyň aşaky suratynda diňe Gas1-GFP (1-nji surat) ýa-da diňe Mid2-iRFP (2-nji surat) bolan ERES-iň iki tipik mysaly görkezilýär. Tersine, ERES-iň takmynan 20% -inde bir ýerde gabat gelýän iki ýük bar. Käbir ERES-iň (10%) iki görnüşli ýüküň bardygy, ýöne olaryň aýdyň tapawutly ýerlerde bölünip goýlandygy anyklandy. Şonuň üçin bu statistik seljerme ER eksport edilenden soň, GPI-AP Gas1-GFP we transmembran ýüküniň Mid2-iRFP-niň dürli ERES-lere bölünýändigini görkezýär (2D surat). Bu sortlama netijeliligi öňki biohimiki analiz (6) we morfologiki kesgitleme (7) bilen örän gabat gelýär. Şeýle hem, ERES-e girýän karantin astyndaky ýüküň özüni alyp barşyny synlap bileris (2E surat we S2 filmi). 2E suratda Gas1-GFP-niň (3-nji panel) ýa-da Mid2-iRFP-niň (4-nji panel) diňe kiçi bir böleginiň ERES-e bir tarapdan girýändigi we aýratyn bir ýerde ýerleşýändigi görkezilýär. 2E suratyň 5-nji panelinde Gas1-GFP we Mid2-iRFP-niň käwagt şol bir ERES-de tapylýandygy, ýöne olaryň dürli taraplardan girýändigi we dürli COPII wezikulalaryny görkezip biljek aýry-aýry sebitlerde jemlenýändigi görkezilýär. Şeýle hem, C26 keramid esasly GPI-AP Gas1-iň selektiw ERES hökmünde synlanan bölünmeginiň we klassifikasiýasynyň aýratyndygyny tassykladyk, sebäbi başga bir transmembran sekresiýa ýüki, GFP bilen belgilenen plazma membrana belogy Axl2 (27), Mid2-iRFP-e meňzeş özüni alyp barşyny görkezýär. (S1 surat we S3 filmi). Täze sintezlenen Axl2-GFP ER membranasy arkaly Mid2-iRFP ýaly paýlanýar (S1, A we B surat) we ERES-iň köpüsinde Mid2-iRFP bilen bilelikde ýerleşýär (S1, B-D surat). 1-nji suratyň 1-nji we 2-nji panelleri. S1C iki transmembran ýüküniň üst-üste düşýän ERES-iň iki tipik mysalyny görkezýär. Bu ýagdaýlarda iki haryt hem ERES-e bilelikde girýär (S1E surat, 3-nji panel we S3 filmi).
Galaktoza induksiýa edilýän sekretsiýalary beýan edýän sec31-1 öýjükleri, Gas1-GFP (GPI-AP, ýaşyl) we Mid2-iRFP (TMP, gök) we Sec13-mCherry (ERES, magenta) ýaly konstitutiw ERES belgilemeli öýjükler 37°C-de ýerleşdirildi. 30 minut °C-de inkubasiýa edilenden soň, sekresiýa blokuny boşatmak üçin 24°C-e geçiň we 20 minutdan soň SCLIM bilen surat düşüriň. (A-dan C-a çenli) Ýüküň we ERES bilen bellenen 10 z-bölümiň wekilçilikli 2D proýeksiýa suratlary (A; ölçeg çyzygy, 1μm) ýa-da 3D öýjük ýarymşar suratlary (B we C; ölçeg birligi, 0.456μm). (B)-däki aşaky panel we (C)-däki panel diňe ERES-de (magenta) bar bolan harytlary görkezmek üçin işlenen suratlary görkezýär [Gas1-GFP (çal) we Mid2-iRFP (açyk gök)]. (C) Açyk ok: ERES diňe bir ýük bölegini daşaýar (1-den 4-e çenli). Çal ok: ERES bölünen ýükleri öz içine alýar (5). Ak reňkli berk ok: bilelikde ýerleşýän ýükleri öz içine alýan ERES. Aşakda: Saýlanan ýeke ERES diňe Gas1-GFP (1) ýa-da Mid2-iRFP (2) öz içine alýar. Ölçeg çyzygy, 100 nm. (D) (C)-de beýan edilen fotomikrografyň mukdary. Diňe bir ýüki (Gas1-GFP ýa-da Mid2-iRFP), bölünen ýükleri we üst-üste düşýän ýükleri öz içine alýan ERES-iň ortaça göterimi. Üç garaşsyz synagda 54 öýjükde n=432. Ýalňyşlyk çyzygy = SD. Iki guýrukly jübütsiz t synagy. *** P = 0.0002. (E) (C) bilen bellenen karantinlenen ýükleriň saýlanan ERES-iniň 3D şekili. Gas1-GFP (ýaşyl) (3) ýa-da Mid2-iRFP (gök) (4) bir tarapdan ERES-e (magenta) girýär we ERES-iň içinde kiçi bir meýdan bilen çäklendirilýär. Käwagt iki görnüşli ýük hem şol bir ERES-e (5) bir tarapdan girýär we ERES-iň içinde aýratyn bir meýdan bilen çäklendirilýär. Ölçeg çyzygy, 100 nm.
Soňra, ER membranasynda bar bolan uzyn asil zynjyrly keramidiň (C26) Gas1-iň selektiw ERES-e bölünmegini we sortlanmagyny amala aşyrýandygy baradaky gipotezany synagdan geçirdik. Şu maksat bilen, biz üýtgedilen GhLag1 drožži ştammyny ulandyk, onda iki endogen keramid sintazasy Lag1 we Lac1 GhLag1 (pagtanyň Lag1 gomology) bilen çalşyryldy, netijede öýjük membranasy ýabany görnüşdäkiden gysga Seramid ştammly drožži ştammy emele geldi (3A surat) (28). Mass spektrometriýasy (MS) seljermesi ýabany görnüşdäki ştammlarda umumy keramidiň 95% -iniň örän uzyn (C26) zynjyrly keramiddigini, GhLag1-de bolsa keramidiň 85% -iniň örän uzyn (C18 we C16) bolandygyny görkezdi. ), keramidiň diňe 2% -iniň örän uzyn (C26) zynjyrly keramiddigini görkezdi. Häzirki wagta çenli GhLag1 membranasynda C18 we C16 keramidleri anyklanan esasy keramidler bolsa-da, MS analizi GhLag1 ştammynda görkezilen Gas1-GFP-niň GPI ankeriniň ýabany tipli lipidler bilen deňeşdirip boljak C26 keramidini öz içine alýandygyny hem tassyklady. Hili birmeňzeş (3A surat) (26). Şonuň üçin bu keramidleri täzeden gurýan Cwh43 fermentiniň C26 keramid üçin ýokary derejede selektiwdigini aňladýar, 26-njy suratda görkezilişi ýaly, ol GhLag1 ştammyndaky az mukdarda C26 keramidinden GPI ankerini artykmaçlyk bilen öz içine alýar. S2 (29). Şeýle-de bolsa, GhLag1-iň öýjük membranasy esasan diňe C18-C16 keramidini öz içine alýar, Gas1-GFP bolsa henizem C26 keramidini öz içine alýar. Bu fakt bu ştammy ER-de membran keramidiniň asil zynjyrynyň uzynlygy meselesini aýratyn çözmek üçin ideal gurala öwürýär. Klassyň we sortlamagyň gipotetiki roly. Soňra, ilki bilen, biz C26 Gas1-GFP-niň GhLag1-de temperatura duýgur mutant alleli sec31-1 bilen klasterlerde toplanmak ukybyny adaty fluoresensiýa mikroskopiýa arkaly öwrendik, bu ýerde diňe uzyn (C18-C16) zynjyr ER membranasynda, Seramidde bar (3-nji surat). Biz sec31-1-de Gas1-GFP-niň köp böleginiň klasterlerde jemlenendigini, uzyn (C18-C16) uzyn keramid ER membranasynda bolsa sec31-1 GhLag1-de Gas1-GFP-niň bolsa esasan klasterleşdirilmändigini we tutuş ER membranasynda paýlanmandygyny gördük. Has takygy, C26 keramid esasynda klasterleşdirilme belli bir ERES bilen ýakyndan baglanyşykly bolany üçin (1-nji surat), biz soňra bu prosessiň ER eksport belok mehanizminiň funksiýasyny hem öz içine alyp biljekdigini öwrendik. GPI-AP ER eksporty üçin ýörite COPII ulgamyny ulanýar, bu bolsa GPI ankeriniň glikan böleginiň Ted1-iň gurluş taýdan täzeden gurulmagy bilen işjeň düzgünleşdirilýär (30, 31). Rekombinant GPI-glikan soňra transmembran ýük reseptory p24 toplumy tarapyndan tanalýar, ol bolsa öz gezeginde esasy COPII ýük baglanyşyk bölümi Sec24-iň spesifik izoformy bolan Lst1-i selektiw usulda işe alýar we GPI-AP-a baý COPII köpürjiklerini emele getirýär (31-33). Şonuň üçin biz bu ýeke-täk beloklaryň (p24 toplumynyň komponenti Emp24, GPI-glikan täzeden gurluş fermenti Ted1 we spesifik COPII bölümi Lst1) delesiýasyny sec31-1 mutant ştammy bilen birleşdirýän goşa mutant gurduk we olary öwrendik. Gas1-klaster GFP emele getirmek mümkinmi (3-nji surat). Biz sec31-1emp24Δ we sec31-1ted1Δ-da Gas1-GFP-niň esasan klasterleşdirilmedik we ER membranasynyň ähli ýerinde paýlanandygyny, öň sec31-1 GhLag1-de görkezilişi ýaly, sec31-1lst1Δ-da bolsa Gas1-GFP-niň sec31-1 ýalydygyny gördük. Bu netijeler ER membranasynda C26 keramidiň bolmagyndan başga-da, Gas1-GFP-niň klasterleşdirilmeginiň p24 kompleksine baglanmagynyň zerurdygyny we belli bir Lst1 işe alynmagyny talap etmeýändigini görkezýär. Soňra, ER membranasyndaky keramidiň zynjyr uzynlygynyň Gas1-GFP-niň p24-e baglanmagyny düzgünleşdirip biljekdiginiň mümkinçiligini öwrendik. Şeýle-de bolsa, membranada C18-C16 keramidiň bolmagynyň p24 kompleksi tarapyndan dikeldilen GPI-glikanlara (S3 we S4, A we B suratlar) ýa-da GPI-AP-a baglanyp, GPI-AP-ny eksport etmek ukybyna täsir etmeýändigini anykladyk. COPII kiçi görnüşini Lst1 işe alyň (S4C surat). Şonuň üçin, C26 keramid bagly klasterleşme dürli ER eksport belok mehanizmleri bilen belogyň özara täsirini talap etmeýär, ýöne lipid uzynlygy bilen dolandyrylýan alternatiw sortlama mehanizmini goldaýar. Soňra, ER membranasyndaky keramid asil zynjyrynyň uzynlygynyň Gas1-GFP-niň selektiw ERES hökmünde netijeli klassifikasiýa üçin möhümdigini ýa-da möhüm däldigini seljerdik. Gysga zynjyrly keramidli GhLag1 ştammyndaky Gas1 ER-den çykyp, plazma membranasyna girýändigi üçin (S5 surat), eger sortlama keramid asil zynjyrynyň uzynlygy bilen dolandyrylýan bolsa, GhLag1 ştammyndaky Gas1-iň gaýtadan gönükdirilip we kesişip boljakdygyna ynanýarys. Şol bir membrana bilen ERES harytlary.
(A) GhLag1-iň öýjük membranasy esasan gysga C18-C16 keramidlerini öz içine alýar, Gas1-GFP-niň GPI ankeri bolsa ýabany görnüşli öýjükler bilen birmeňzeş C26 IPC-e eýedir. Ýokarda: ýabany görnüşli (Wt) we GhLag1p ştammlarynyň öýjük membranasyndaky keramidiň asil zynjyr uzynlygynyň analizi massa spektrometriýasy (MS) arkaly. Maglumatlar umumy keramidiň göterimini görkezýär. Üç garaşsyz synagyň ortaça bahasy. Ýalňyşlyk zolagy = SD. Iki guýrukly jübütsiz t synagy. **** P <0.0001. Aşakdaky panel: ýabany görnüşli we GhLag1p ştammlarynda beýan edilen Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ankerinde bar bolan IPC-niň asil zynjyr uzynlygynyň MS analizi. Maglumatlar umumy IPC signalynyň göterimini görkezýär. Bäş garaşsyz synagyň ortaça bahasy. Ýalňyşlyk zolagy = SD. Iki guýrukly jübütsiz t synagy. ns, möhüm däl. P = 0.9134. (B) Galaktoza bilen döredilen Gas1-GFP ekspresirleýän sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ we sec31-1lst1Δ öýjükleriniň fluoresensiýa mikrograflary 37°C-da 30 minutlap inkubasiýa edildi we 24°C-dan soň adaty fluoresensiýa mikroskopiýasyny ýerine ýetirmek üçin aşak geçirildi. Ak ok: ER Gas1-GFP klasteri. Açyk ok: Klasterlenmedik Gas1-GFP tutuş ER membranasynda paýlanyldy we ER-iň häsiýetli ýadro halkasynyň boýalmagyny görkezýär. Ölçeg çyzygy, 5μm. (C) (B)-de beýan edilen fotomikrografyň mukdary. Nuktaly Gas1-GFP gurluşy bolan öýjükleriň ortaça göterimi. Üç garaşsyz synagda n≥300 öýjük. Ýalňyşlyk çyzygy = SD. Iki guýrukly jübütlenmedik t synagy. **** P <0.0001.
Bu meseläni gönüden-göni çözmek üçin, biz sec31-1 temperatura duýgur mutant alleli bilen GhLag1-de Gas1-GFP we Mid2-iRFP-niň SCLIM wizualizasiýasyny geçirdik (4-nji surat we S4 filmi). ER 37°C-de saklanyp, soňra 24°C-de boşadylandan soň, täze sintezlenen Gas1-GFP-niň köpüsi klasterleşdirilmedi we ER membranasynyň ähli ýerinde paýlanmady, bu adaty mikroskoplar tarapyndan syn edildi (4-nji surat, A we B). Mundan başga-da, ERES-iň uly bölegi (67%) onda bilelikde ýerleşýän iki görnüşli ýüki öz içine alýar (4D surat). 4C suratyň 1-nji we 2-nji panelleri Gas1-GFP we Mid2-GFP-niň üst-üste düşýän ERES-iň iki tipik mysalyny görkezýär. Mundan başga-da, iki haryt hem şol bir ERES-e goşuldy (4E surat, 3-nji panel we S4 filmi). Şonuň üçin, netijelerimiz ER membranasyndaky keramid asil zynjyrynyň uzynlygynyň ER belogynyň agregasiýasynyň we klassifikasiýasynyň möhüm kesgitleýjisidigini görkezýär.
Galaktoza bilen döredilen sekresiýalary beýan edýän Sec31-1 GhLag1 öýjükleri, Gas1-GFP (GPI-AP, ýaşyl) we Mid2-iRFP (TMP, gök) we ERES bilen belgilenen Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C-da inkubasiýa ediň. 30 minut dowam ediň, sekresiýalary çykarmak üçin 24°C-a düşüriň we 20 minutdan soň SCLIM bilen surat alyň. (A-dan C-a çenli) Kargo we ERES bilen bellenen 10 z-bölümiň wekilçilikli 2D proýeksiýa suratlary (A; ölçeg çyzygy, 1μm) ýa-da 3D öýjük ýarymşar suratlary (B we C; ölçeg birligi, 0.45μm). (B)-däki aşaky panel we (C)-däki panel diňe ERES-de bar bolan harytlary (magenta) görkezmek üçin işlenen suratlary görkezýär [Gas1-GFP (çal) we Mid2-iRFP (açyk gök)]. (C) Ak doldurylan ok: ERES, harytlar üst-üste düşýär. Açyk ok: ERES diňe bir elementi öz içine alýar. Aşakky panel: Saýlanan ERES-de (C) bilen bellenen üst-üst bolýan harytlar (1 we 2) bar. Ölçeg çyzygy, 100 nm. (D) (C) bilen görkezilen fotomikrografyň mukdary. 31-1-nji bölümde we 31-1-nji bölümde GhLag1 birliklerinde diňe bir ýük (Gas1-GFP ýa-da Mid2-iRFP) we aýry ýük we üst-üst bolýan ýük üçin ERES-iň ortaça göterimi goşulýar. Üç garaşsyz synagda 54 öýjükde n = 432 (31-1-nji bölüm) we 47 öýjükde n = 430 (31-1-nji bölüm GhLag1). Ýalňyşlyk çyzygy = SD. Iki guýrukly jübütsiz t synagy. *** P = 0.0002 (31-1-nji bölüm) we ** P = 0.0031 (31-1-nji bölüm GhLag1). (E) (C) bilen bellenen üst-üst bolýan ýük (3) bilen saýlanan ERES-iň 3D şekili. Gas1-GFP (ýaşyl) we Mid2-iRFP (gök) ERES-e (magenta) bir tarapdan ýakynlaşýarlar we şol bir ERES çäklendirilen zolagynda galýarlar. Ölçeg çyzygy, 100 nm.
Bu gözleg lipid esasly belok ýükleriniň sekresiýa ýolunda selektiw eksport ýerlerine bölünýändigini görkezýän in vivo subutnamalaryny gönüden-göni berýär we klassifikasiýa selektiwligi üçin asil zynjyrynyň uzynlygynyň möhümdigini açyp görkezýär. SCLIM atly güýçli we öňdebaryjy mikroskopiýa tehnikasyny ulanyp, biz drožžadaky täze sintezlenen Gas1-GFP-ni (örän uzyn asil zynjyrly (C26) keramid lipid bölegi bolan esasy plazma membranasy GPI-AP) görkezdik. ) Aýratyn ER-lerde toplanan sebitler belli bir ERES bilen baglanyşyklydyr, transmembran bölünip çykarylan beloklar bolsa ER membranasynyň ähli ýerinde paýlanýar (1-nji surat). Mundan başga-da, bu iki görnüşli harytlar dürli ERES-lere selektiw usulda girýär (2-nji surat). Membranadaky öýjük keramidiň asil zynjyrynyň uzynlygy C26-dan C18-C16-a çenli azalýar, Gas1-GFP klasteri aýratyn ER sebitine bölünýär we Gas1-GFP şol bir ERES arkaly transmembran belok bilen ER-den çykmak üçin täzeden gönükdirilýär (3-nji surat we 3-nji surat). 4).
GPI-AP ER-den çykmak üçin ýöriteleşdirilen belok mehanizmini ulansa-da, biz C26 keramidine bagly bölünişiň ERES-iň ýöriteleşmegine getirip biljek dürli belok özara täsirlerine bagly däldigini anykladyk (S4 we S5 suratlar). Munuň ýerine, biziň netijelerimiz lipid esasly belok toparlanmagy we soňraky beýleki ýükleriň çykarylmagy bilen hereket edýän alternatiw klassifikasiýa mehanizmini goldaýar. Biziň synlarymyz belli bir ERES bilen baglanyşykly Gas1-GFP sebitinde ýa-da klasterinde transmembran bölünip çykarylýan belok Mid2-iRFP ýokdugyny görkezýär, bu bolsa C26 keramidine bagly GPI-AP klasteriniň olaryň degişli ERES-e girmegini ýeňilleşdirjekdigini we şol bir wagtyň özünde transmembran bölünişlerini çykarjakdygyny görkezýär (1-nji we 2-nji suratlar). Tersine, ER membranasynda C18-C16 keramidleriniň bolmagy GPI-AP-nyň sebitleri ýa-da klasterleri döretmegine sebäp bolmaýar, şonuň üçin olar transmembran bölünip çykarylýan beloklary şol bir ERES-e çykarmaýar ýa-da çalşmaýar (3-nji we 4-nji suratlar). Şonuň üçin biz C26 keramidi belli bir ERES bilen baglanyşykly beloklaryň toparlanmagyny ýeňilleşdirmek arkaly bölünmegi we klassifikasiýany höweslendirýändigini teklip edýäris.
Bu C26 keramidine bagly klasterleşmegi belli bir ER meýdanyna nädip gazanmaly? Membran keramidiniň gapdaldan bölünmek meýli GPI-AP we C26 keramidiniň gysga we doýmadyk gliserolipidleri öz içine alýan ER membranasynyň has düzgünsiz lipid gurşawynda kiçi we derrew tertipleşdirilen lipidleri emele getirmegine sebäp bolup biler. Hil klasterleri (17, 18). Bu kiçi wagtlaýyn klasterler p24 toplumyna baglanandan soň has uly, has durnukly klasterlere birleşip bilner (34). Muňa laýyklykda, biz C26 Gas1-GFP-niň has uly görünýän klasterleri emele getirmek üçin p24 toplumy bilen özara täsirleşmelidigini görkezdik (3-nji surat). p24 toplumy, drožžide dört dürli p24 transmembran beloklaryndan düzülen geterozigot oligomerdir (35), ol köp walentli baglanyşy üpjün edýär, bu bolsa kiçi GPI-AP klasterleriniň özara baglanyşmagyna getirip biler we şeýdip has uly Durnukly klasteri emele getirýär (34). GPI-AP-laryň belok ektodomenleriniň arasyndaky özara täsir, süýdemdirijileriň polýarlaşan epitelial öýjüklerinde Golgi daşamagynda görkezilişi ýaly, olaryň agregasiýasyna hem goşant goşup biler (36). Şeýle-de bolsa, ER membranasynda C18-C16 keramidi bolanda, p24 toplumy Gas1-GFP bilen baglananda, uly aýry klasterler emele gelmez. Esasy mehanizm uzyn asil zynjyrly keramidiň aýratyn fiziki we himiki häsiýetlerine bagly bolup biler. Emeli membranalaryň biofiziki barlaglary, uzyn (C24) we gysga (C18-C16) asil zynjyrly keramidleriň faza bölünmegine sebäp bolup bilse-de, diňe uzyn asil zynjyrly keramidleriň (C24) ýokary egriligi we plýonkanyň şekilini üýtgetmek üçin bükülmegini höweslendirip bilýändigini görkezýär. Özara salgylanma arkaly (17, 37, 38). Emp24-iň adam gomology bolan TMED2-niň transmembran spiralynyň sitoplazmatiki lobulalarda C18 keramid esasly sfingomielin bilen selektiw täsirleşýändigi görkezildi (39). Molekulýar dinamika (MD) simulýasiýalaryny ulanyp, biz C18 we C26 keramidleriniň Emp24 transmembran spiralynyň sitoplazmatiki lobulalarynyň töwereginde toplanýandygyny we olaryň meňzeş islegleriniň bardygyny anykladyk (S6-njy surat). Munuň Emp24-iň transmembran spiralynyň membranada lipidleriň assimetrik paýlanmagyna getirip biljekdigini görkezýändigini bellemek gerek. Bu süýt emdirijileriň öýjüklerine esaslanýan ýakynda alnan netije. Şeýle MD simulýasiýalary efir lipidleriniň bardygyny hem görkezýär (40). Şonuň üçin, ER26-nyň iki lobulasyndaky C26 keramidiň ýerli baýlaşdyrylandygyny çaklaýarys. GPI-AP lüminal lobulalarda köp walentli p24 bilen gönüden-göni baglananda we sitoplazmatik lobulalarda p24 töwereginde C26 keramidiň toplanmagy bilen, ol barmaklar arkaly belogyň agregasiýasyny we membrana egriliginiň döremegini höweslendirip biler (41), bu bolsa GPI-AP-nyň ERES-iň golaýyndaky aýry sebitlere bölünmegine sebäp bolýar, bu bolsa ER membranasynyň ýokary egri sebitlerine hem ýardam edýär (42). Öňki habarlar teklip edilýän mehanizmi goldaýardy (43, 44). Plazma membranasynda oligolektinleriň, patogenleriň ýa-da antitelalaryň keramid esasly glikosfingolipidlere (GSL) köp walentli baglanmagy uly GSL agregasiýasyny döredýär, faza bölünmegini güýçlendirýär we membrananyň deformasiýasyna we içkileşmegine sebäp bolýar (44). Iwabuçi we ş.m. (43) Uzyn (C24), ýöne gysga (C16) däl asil zynjyrlarynyň barlygynda, GSL laktosilseramide baglanan köpwalentli ligandyň uly klasterleriň emele gelmegine we membrana inwaginasiýasyna sebäp bolýandygy we sitoplazmanyň Lyn arkaly ýarlyklardaky signalyň geçirilmeginiň baglanyşykly neýtrofillerde asil zynjyrlary bilen özara baglanyşýandygy anyklandy.
Süýt emdirijileriň polýarlaşan epitelial öýjüklerinde, Golgi garşy torunyň (TGN) apikal plazma membranasynyň derejesine konsentrasiýasy GPI-AP-nyň bölünmegini we sortlanmagyny gözegçilikde saklaýar (10, 45). Bu agregasiýa GPI-AP oligomerleşmesi bilen amala aşyrylýar (36), ýöne ol drožžalarda duş gelýän keramid zynjyrynyň uzynlygyna hem bagly bolup biler. Süýt emdirijileriň GPI-AP-sy efir lipid esasly löwhere eýe bolsa-da we onuň himiki gurluşy örän uzyn asil zynjyrly keramidden düýpgöter tapawutlansa-da, ýakynda geçirilen bir gözlegde iki lipidiň hem ewolýusiýa taýdan meňzeş fiziki we himiki häsiýetlere we funksiýa eýedigi anyklandy (40). Şonuň üçin süýt emdirijileriň öýjüklerinde efir lipid bölegi drožžadaky C26 keramidine meňzeş bolup biler we onuň roly membranadaky uzyn zynjyrly keramid bilen birleşip, GPI-AP agregasiýasyny we sortlanmagyny höweslendirmekdir. Bu mümkinçiligiň gönüden-göni synagdan geçirilmegi zerur bolsa-da, öňki netijeler uzyn asil zynjyrly keramidiň Golgi bedenine daşalmagynyň sitoplazmatiki geçiriji beloklar tarapyndan amala aşyrylmaýandygyny, emma drožži ýaly GPI ankerleriniň sintezine baglydygyny tassyklaýar. Şonuň üçin ewolýusiýa konserwatiw mehanizmi örän uzyn asil zynjyrly keramidi we GPI-AP-ny (13, 16, 20, 46, 47) şol bir daşaýjy gutda saýlama usulda bilelikde daşamaga ukyply ýaly görünýär.
Aşhana we süýdemdirijileriň polýarlaşan epitelial öýjük ulgamlarynda GPI-AP agregasiýasy we beýleki plazma membrana beloklaryndan aýrylmagy öýjük ýüzüne ýetmezden öň bolup geçýär. Paladino we beýlekiler (48) süýdemdirijileriň polýarlaşan epitelial öýjükleriniň TGN-inde GPI-AP klasterleşmesiniň diňe bir GPI-AP-laryň apikal plazma membranasyna selektiw klassifikasiýa üçin zerur däldigini, eýsem GPI-AP-laryň klasterleşme guramagyny we onuň biologiki işjeňligini hem düzgünleşdirýändigini anykladylar. Öýjük ýüzü. Aşhanada bu gözleg ER-däki C26 keramid-garaşly GPI-AP klasteriniň plazma membranasyndaky GPI-AP klaster guramagyny we funksional işjeňligini düzgünleşdirip biljekdigini görkezdi (24, 49). Bu modele laýyklykda, GhLag1 öýjükleri GPI ingibitorlaryna ýa-da öýjük diwarynyň bitewüligine täsir edýän dermanlara allergiýa bildirýär (28) we aşhana öýjükleriniň birleşmesinde proýektirlenýän uç keramidiň funksional Gas1-GFP klasterlerine zerurlyk (49) G-ni görkezýär hLag1 öýjükleriniň mümkin bolan fiziologiki netijeleri. GPI-AP ýalňyşlygy. Şeýle-de bolsa, öýjük ýüzüniň funksional gurluşynyň lipid uzynlygyna esaslanýan sortlama usuly bilen ER-den programmirlenendigini ýa-da edilmedigini mundan beýläk barlamak biziň geljekki gözleglerimiziň temasy bolar.
Bu işde ulanylan Saccharomyces cerevisiae ştammlary S1 tablisasynda görkezilen. Diri öýjük şekilleri üçin SCLIM-iň MMY1583 we MMY1635 ştammlary W303-iň fonunda guruldy. Fluorescent belok tagly Sec13-mCherry-ni ekspresirleýän bu ştammlar şablon hökmünde pFA6a plazmid bilen polimeraza zynjyr reaksiýasyna (PCR) esaslanýan usul arkaly guruldy (23). GAL1 promotorynyň gözegçiligi astynda fluorescent belok bilen etiketlenen Mid2-iRFP ekspresirleýän ştamm aşakdaky ýaly guruldy. pKTiRFP-KAN wektoryndan iRFP-KanMx yzygiderliliginiň PCR güýçlendirilmegi (E. O'Shea-nyň sowgady, Addgene plazmid belgisi 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ylmy çeşme identifikatory (RRID): Addgene_64687) we endogen Mid2-niň C-terminalyna girizildi. Mid2-iRFP genom yzygiderligi GAL1 promotoryna güýçlendirilip, klonlaşdyrylandan soň, ol pRS306 integrasiýa plazmidiniň Not I-Sac I ýerine integrasiýa edildi. Netijede dörän pRGS7 plazmidasy URA3 lokusyna integrasiýa etmek üçin Pst I bilen linearlaşdyryldy.
Gas1-GFP birleşme geni GAL1 promotorynyň gözegçiligi astynda sentromer (CEN) plazmidinde ekspressiýa edilýär, ol aşakdaky ýaly gurulýar. Gas1-GFP yzygiderliligi pRS416-GAS1-GFP plazmidinden (24) (L. Popolonyň sowgady) PCR arkaly güýçlendirildi we CEN plazmidiniň pBEVY-GL LEU2-niň (C-niň sowgady) Xma I–Xho I ýerine klonlaşdyryldy. Miller; Addgene plazmid belgisi 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Netijede dörän plazmid pRGS6 diýlip atlandyryldy. Axl2-GFP birleşme geni hem pBEVY-GL LEU2 wektorynyň GAL1 promotorynyň gözegçiligi astynda ekspressiýa edilýär we onuň gurluşy aşakdaky ýaly. Axl2-GFP yzygiderliligi pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidinden (23) PCR arkaly güýçlendirildi we pBEVY-GL LEU2 wektorynyň Bam HI-Pst I ýerine klonlaşdyryldy. Netijede dörän plazmid pRGS12 diýlip atlandyryldy. Bu gözlegde ulanylan oligonukleotidleriň yzygiderliligi S2 tablisasynda görkezilen.
Ştamm uglerod çeşmesi hökmünde 0,2% adenin we 2% glýukoza [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinoza [YP-rafinoza] baý drožža ekstrakty belok p (YP) ortamy (1% drožža ekstrakty we 2% belok ept). (YPR)] ýa-da 2% galaktoza [YP-galaktoza (YPG)] bilen ýa-da iýmit üçin zerur bolan degişli aminokislotalary we esaslary doldurmak üçin sintetiki minimal ortamda (0,15% drožža azot esasy we 0,5% ammonium sulfat) goşuldy we uglerod çeşmesi hökmünde 2% glýukoza (sintetiki glýukoza minimal ortamy) ýa-da 2% galaktoza (sintetiki galaktoza minimal ortamy) saklady.
Real wagt suratlandyrmasy üçin, GAL1 promotorynyň aşagynda gurluş ekspresirleýän temperatura duýgur sec31-1 mutant öýjükleri YPR gurşawynda 24°C-de gije-gündiz orta log fazasyna çenli ösdürilip ýetişdirildi. 24°C-de YPG-de 1 sagat induksiýa edilenden soň, öýjükler 37°C-de SG-de 30 minutlap inkubasiýa edildi we soňra bölünip çykma blokundan çykmak üçin 24°C-e geçirildi. Öýjükleri aýna slaýda berkitmek we SCLIM arkaly suratlandyrmak üçin Konkanavalin A ulanyldy. SCLIM, Olympus IX-71 ters fluoresensiýa mikroskopynyň we UPlanSApo 100 × 1.4 sanly apertura ýag linzasynyň (Olympus), ýokary tizlikli we ýokary signal-şowhun gatnaşygy bolan aýlanýan disk konfokal skaneri (Yokogawa Electric), ýörite spektrometriň we ýörite sowadyjynyň utgaşmasydyr. Ulgamyň surat güýçlendirijisi (Hamamatsu Photonics) × 266.7 gutarnykly ulaldyşly linza ulgamyny we elektronlary köpeldýän zarýad bilen baglanyşykly enjam kamerasyny (Hamamatsu Photonics) üpjün edip biler (21). Surat almak ýörite programma üpjünçiligi (Yokogawa Electric) tarapyndan amala aşyrylýar. 3D suratlar üçin, obýektiw linzany dikligine titretmek üçin ýörite ýasalan pýezoelektrik hereketlendirijini ulandyk we optiki bölekleri 100 nm aralykda bir stekde ýygnadyk. Z-stek suraty 3D woksel maglumatlaryna öwrülýär we aýlanýan disk konfokal mikroskop üçin ulanylýan nazary nokat ýaýratma funksiýasy Volocity programma üpjünçiligi (PerkinElmer) tarapyndan dekonwolusiýa işlemegi üçin ulanylýar. Kolokasiýa seljermesi üçin awtomatiki usulda Volocity programma üpjünçiligini ulanmak arkaly ýükleri öz içine alýan ERES ölçeldi. Çyzyk skanirleme seljermesi MetaMorph programma üpjünçiligi (Molecular Devices) arkaly geçirildi.
Statistik ähmiýeti kesgitlemek üçin GraphPad Prism programma üpjünçiligini ulanyň. Iki taraply Studentiň t-testi we adaty bir taraply dispersiýa analizi (ANOVA) testi üçin toparlaryň arasyndaky tapawutlaryň P <0.05 (*)-e uly täsir edýändigi hasaplanylýar.
Gas1-GFP-niň fluoresensiýa mikroskopiýasynda log faza öýjükleri YPD-de bir gije ösdürilip, santrifuga arkaly ýygnaldy, iki gezek fosfat buferli duzly ergin bilen ýuwuldy we buzda azyndan 15 minut inkubasiýa edildi, soňra bolsa öň beýan edilişi ýaly mikroskop astynda dowam etdirildi (24). Almak üçin obýektiw linza, L5 (GFP) süzgüç, Hamamatsu kamerasy we Application Suite X (LAS X) programma üpjünçiligi bilen üpjün edilen Leica DMi8 mikroskopy (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ulanyldy.
Nusgalar 65°C-da 10 minutlap SDS nusga buferi bilen denaturasiýa edildi we soňra SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE) bilen bölündi. Immunoblotting analizi üçin her bir liniýa 10 μl nusga ýüklendi. Esasy antitela: 1:3000 suwuklandyrylanda towşan poliklonal anti-Gas1, 1:500 suwuklandyrylanda towşan poliklonal anti-Emp24 we 1:3000 suwuklandyrylanda towşan poliklonal anti-GFP (H. Riezmanyň sowgady) ulanyň. Syçan monoklonal anti-Pgk1 antitela 1:5000 suwuklandyrylanda ulanyldy (J. de la Kruzyň sowgady). Ikinji antitela: 1:3000 suwuklandyrylanda ulanylan hren peroksidazasy (HRP) konýugeirlenen geçi towşan anti-towşan immunoglobulini G (IgG) (Pirs). HRP bilen birleşdirilen geçi syçanlara garşy IgG 1:3000 (Pirs) suwuklandyrylmagynda ulanyldy. Immun reaksiýa zolagy SuperSignal West Pico reaksiýasynyň (Thermo Fisher Scientific) himiluminesensiýa usuly bilen syn edildi.
(31)-de beýan edilişi ýaly, baýlaşdyrylan ER fraksiýasynda tebigy immunopresipitasiýa tejribesi geçirildi. Gysgaça aýdylanda, drožža öýjüklerini TNE buferi [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil ftorid we proteaza ingibitor garyndysy) bilen 600 nm-de (OD600) 100 optik dykyzlykda iki gezek ýuwuň. Ol aýna munçuklar bilen döwüldi, soňra öýjük galyndylary we aýna munçuklar santrifuga arkaly aýryldy. Soňra supernatant 17,000 g-da 4°C-da 15 minutlap santrifuga edildi. Pellet TNE-de gaýtadan suspenziýa edildi we digitalis saponini 1% gutarnykly konsentrasiýa goşuldy. Süspenziýa 4°C-da aýlanyp 1 sagatlap inkubasiýa edildi, soňra eremeýän komponentler 13,000 g-da 4°C-da 60 minutlap santrifuga arkaly aýryldy. Gas1-GFP immunoprecipitasiýa üçin ilki bilen nusgany boş agaroza merjenleri (ChromoTek) bilen 4°C-da 1 sagatlap öňünden inkubasiýa ediň, soňra GFP-Trap_A (ChromoTek) bilen 4°C-da 3 sagatlap inkubasiýa ediň. Immunoprecipitasiýa edilen merjenler 0,2% digoksigenin saklaýan TNE bilen bäş gezek ýuwuldy, SDS nusga buferi bilen elusiýa edildi, SDS-PAGE-de bölünip alyndy we immunoblotting arkaly seljerildi.
(31)-de beýan edilişi ýaly, baýlaşdyrylan ER fraksiýasynda özara baglanyşyk kesgitlemesi geçirildi. Gysgaça aýdylanda, baýlaşdyrylan ER fraksiýasy 0,5 mM ditiobis (suksinimidil propionat) bilen inkubasiýa edildi (Pirs, Thermo Fisher Scientific, Rokford, IL, ABŞ; 20°C, 20 min). Özara baglanyşyk reaksiýasy glisin goşmak bilen söndürildi (50 mM soňky konsentrasiýa, 5 minut, 20°C).
Öň beýan edilişi ýaly (50), ýabany görnüşli we GhLag1 ştammlarynda keramidiň MS analizi geçirildi. Gysgaça aýdylanda, öýjükler 30°C-da YPD-de eksponensial faza (3-den 4 OD600 birlik/ml-e çenli) ösdürilip ýetişdirildi we 25×107 öýjük ýygnaldy. Olaryň metabolizmi trihlorsirke turşusy bilen söndürilýär. Ekstraksiya erginini [etanol, suw, efir, piridin we 4.2 N ammonium gidroksid (15:15:5:1:0.018 v/v)] we içki standart C17 keramidi (860517, Avanti polýar lipid) hilli 1.2 nmol ulanyň. Ekstraktyň ýeňil gidrolizini amala aşyrmak üçin monometilamin reagentini [metanol, suw, n-butanol we metilamin ergini (4:3:1:5 v/v)] ulanyň, soňra duzsuzlaşdyrmak üçin suw bilen doýgun n-butanol ulanyň. Ahyrsoňy, ekstrakt pozitiw režimli erginde [hloroform/metanol/suw (2:7:1) + 5 mM ammonium asetat] gaýtadan suspenziýa edildi we massa spektrometrine girizildi. Sfingolipid molekulalaryny kesgitlemek we mukdaryny kesgitlemek üçin köp reaksiýaly gözegçilik (MRM) geçirildi. TSQ Vantage üçünji derejeli kwadrupol massa spektrometri (Thermo Fisher Scientific) lipid analizi üçin robot nanoflow ion çeşmesi Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) bilen enjamlaşdyrylan. Çaknyşyk energiýasy her bir keramid kategoriýasy üçin optimizirlenen. MS maglumatlary pozitiw režimde alyndy. Her bir biologik gaýtalanma üçin lipid signaly üç garaşsyz ölçegiň medianasydyr.
(31)-de beýan edilişi ýaly, Gas1-GFP ekspresirleýän öýjükler (800 × 107) tebigy immunopresipitasiýa sezewar edildi. Arassalanan Gas1-GFP SDS-PAGE arkaly bölünip, poliwiniliden ftorid (PVDF) membrana geçirildi. Belok PVDF-ni amid gara reňk bilen boýamak arkaly görkezildi. Gas1-GFP zolagy PVDF-den kesildi we 5 gezek metanol bilen, bir gezek bolsa suwuk hromatografiýa-MS (LC-MS) derejeli suw bilen ýuwuldy. Membran zolagyny 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bufer we 500μl täze ereýän 1 M natriý nitrit garyndysy bilen 37°C-de 3 sagatlap inkubasiýa etmek arkaly lipid fraksiýasy Gas1-GFP-den boşadylýar we lizislenýär. Glýukozamin bilen inositolyň arasyndaky inozin fosfat keramidiň boşadylmagy (51). Şondan soň, membrana zolagy LC-MS derejeli suw bilen dört gezek ýuwuldy, otag temperaturasynda guradyldy we analiz edilýänçä azot atmosferasynda -80°C temperaturada saklandy. Gözegçilik hökmünde her tejribe üçin PVDF membranasynyň boş nusgasy ulanyldy. Soňra Gas1-GFP-den alynýan lipid (50) beýan edilişi ýaly MS arkaly analiz edildi. Gysgaça aýdylanda, GPI-lipid saklaýan PVDF zolaklary 75μl negatiw galyp ergininde [hloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammonium asetat] gaýtadan suspenzasiýa edildi we sfingolipid görnüşleriniň elektrospreý ionlaşmasyndan (ESI) -MRM/MS analizinden (TSQ Vantage) geçirildi. Bu ýagdaýda, MS maglumatlary negatiw ion režiminde alyndy.
Öň belläp geçişimiz ýaly, GPI löwheriniň lipid bölegi [3H]-inositol bilen bellenen GPI-AP-dan (16) bölündi. Lipidler ergin ulgamy (55:45:10 hloroform-metanol-0,25% KCl) ulanylyp inçe gatlakly hromatografiýa arkaly bölündi we FLA-7000 (Fujifilm) arkaly wizuallaşdyryldy.
Gas1-GFP (600 × 107) ekspresirleýän öýjükler iki gezek TNE buferli TNE buferi bilen ýuwuldy we aýna munçuklar bilen döwüldi, soňra öýjük galyndylaryny we aýna munçuklaryny aýyrmak üçin santrifuga edildi. Soňra supernatant 17,000 g-da 4°C-da 1 sagatlap santrifuga edildi. Pellet TNE-de ýuwuldy we 37°C-da 1 sagatlap 0,2% digitalis saponini bolan TNE-de 1 U PI-PLC (Invitrogen) bilen inkubasiýa edildi. Ferment bilen işlenilenden soň, membrana 17,000 g-da 4°C-da 1 sagatlap santrifuga arkaly aýryldy. Gas1-GFP-ni immun çökündi etmek üçin, supernatant 4°C-da gijäniň dowamynda GFP-Trap_A (ChromoTek) bilen inkubasiýa edildi. SDS-PAGE bilen bölünen arassalanan Gas1-GFP Kumassi ajaýyp gök reňki bilen boýaldy. Gas1-GFP reňkleýji zolagy suw geçirijisiniň daş-töweregindäki çal reňkden kesildi, soňra ýodoasetamid bilen alkilleşdirilip, ditiotreitol bilen reduksiýa edilenden soň, tripsin bilen gel içinde ezmek geçirildi. Ekstrakt we guradylan triptik peptidler we GPI-glikanlar bilen peptidler. Gury peptid 20 μl suwda eredildi. Bir bölegini (8 μl) LC-e guýuň. Belli bir gradient şertlerinde peptidleri bölmek üçin oktadesilsilan (ODS) sütün (Develosil 300ODS-HG-5; içki diametri 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aýçi prefekturasy, Ýaponiýa) ulanyldy. Hereket edýän faza A ergininden (0.08% formik kislota) we B ergininden (80% asetonitrilde 0.15% formik kislota) ybaratdyr. Accela HPLC ulgamy (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massaçusets) kolonkany 55 minutlap 50 μl min-1 akym tizliginde A ergini bilen elýutirlemek üçin ulanyldy we soňra B erginiň konsentrasiýasy 40% -e çenli ýokarlandyryldy. , ABŞ). Elýuat ESI ion çeşmesine yzygiderli girizildi we triptik peptidler we GPI-glikanlary bolan peptidler LTQ Orbitrap XL (gibrid çyzykly ion duzagy-orbitrap massa spektrometri; Thermo Fisher Scientific) arkaly seljerildi. MS gurluşynda kapillýar çeşmäniň naprýaženiýesi 4,5 kV-a deňleşdirildi we geçiriji kapillýaryň temperaturasy 300°C-de saklandy. Kapilýar naprýaženiýesi we turba linzasynyň naprýaženiýesi degişlilikde 15 V we 50 V-a deňleşdirildi. MS maglumatlary pozitiw ion režiminde (60,000 çözgüt; millionda 10 bölek massa takyklygy) 300/m/z massa/zarýad gatnaşygy (m/z) 3000 massa aralygynda alyndy. MS/MS maglumatlary LTQ Orbitrap XL-däki ion duzagy arkaly alynýar [maglumatyň bagly bolan ilkinji 3 sany, çaknyşyk sebäpli dissosiasiýa (CID)].
MD simulýasiýalary GROMACS (52) programma üpjünçiligi we MARTINI 2 güýç meýdany (53-55) arkaly ýerine ýetirildi. Soňra CHARMM GUI Membrana Gurujysy (56, 57) dioleoilfosfatidilholin (DOPC) we Cer C18 ýa-da DOPC we Cer C26 saklaýan iki gatlakly gurluş gurmak üçin ulanyldy. Cer C26-nyň topologiýasy we koordinatalary sfingozin guýrugyndan artykmaç munçuklary aýyrmak arkaly DXCE-den alynýar. Goşa gatlagy deňagramlaşdyrmak we ony işletmek üçin aşakda beýan edilen prosesi ulanyň, soňra Emp24 saklaýan ulgamy gurmak üçin ulgamyň soňky koordinatalaryny ulanyň. Emp24-iň transmembran domeni (galyndylar 173-den 193-e çenli) wizual MD (VMD) guralynyň molekulýar gurluşyny (58) ulanyp α-spiral görnüşinde guruldy. Soňra, üst-üst bolýan lipidleri aýyrandan soň, belok iri granulalaşdyryldy we CHARMM GUI ulanyp iki gatlaga girizildi. Soňky ulgam 1202 DOPC we 302 Cer C26 ýa-da 1197 DOPC we 295 Cer C18 we Emp24-i öz içine alýar. Ulgamy 0,150M konsentrasiýa çenli ionlaşdyryň. Iki iki gatlakly kompozisiýa üçin dört garaşsyz gaýtalama edildi.
Lipid iki gatlagy CHARMM GUI prosesi arkaly deňleşdirilýär, bu proses 405,000 ädimi iň pes derejä düşürmegi we soňra deňleşdirmegi öz içine alýar, bu ýerde pozisiýa çäklendirmeleri kem-kemden azaldylýar we aradan aýrylýar, şeýle hem wagt ädimi 0,005 ps-den 0,02 ps-e çenli ýokarlandyrylýar. Deňleşdirilenden soň, ol 0,02 ps wagt ädimi bilen 6 µs öndürýär. Emp24-i girizenden soň, ulgamy iň pes derejä düşürmek we deňleşdirmek üçin şol bir CHARMM GUI prosesini ulanyň we soňra önümçilikde 8 sekuntlap ​​işlediň.
Ähli ulgamlar üçin deňleşdiriş prosesinde basyş Berendsen barostaty (59) tarapyndan, önümçilik prosesinde bolsa basyş Parrinello-Rahman barostaty (60) tarapyndan dolandyrylýar. Ähli ýagdaýlarda ortaça basyş 1 bar we ýarym izotrop basyş birikdiriş shemasy ulanylýar. Deňleşdiriş we önümçilik prosesinde belok, lipid we ergin bölejikleriniň temperaturasyny degişlilikde birikdirmek üçin tizligi gaýtadan kalibrlemeli termostat (61) ulanylýar. Bütin iş dowamynda maksatly temperatura 310K. Baglanyşyksyz özara täsir 0,005 bufer çydamlylygy bolan Verlet shemasyny ulanyp jübüt sanawy döretmek arkaly hasaplanýar. Kulon agzasy reaksiýa meýdany we 1,1 nm kesiş aralygy ulanylyp hasaplanýar. Vander Waals agzasy 1,1 nm kesiş aralygy bolan kesiş shemasyny ulanýar we potensial sürüş üçin Verlet kesiş shemasy ulanylýar (62).
VMD ulanyp, DOPC fosfat şarjagazlary ýa-da keramid AM1 şarjagazlary bilen belogyň arasyndaky kesiş tolkun uzynlygy 0,7 nm-e deňdir we belog bilen özara täsirleşýän lipidleriň sany hasaplanýar. Aşakdaky formula görä, (63)-däki ýaly azalma-baýlaşdyrma (DE) faktoryny hasaplaň: DE faktory = (belogyň umumy lipidleriniň mukdary 0,7) belogyň 0,7-sinde (jemi lipidlerde Cer mukdary)
Hasabat berlen gymmatlyk ortaça hökmünde alynýar we ýalňyşlyk sütunlary SE-niň dört garaşsyz nusgasydyr. DE faktorynyň statistik ähmiýeti t synagy [(ortaçaDE-faktor-1)/SE] arkaly hasaplanýar. Bir taraply paýlanyşdan P bahasyny hasaplaň.
GROMACS guraly yzyň soňky 250 ns içinde Emp24 saklaýan ulgamyň 2D gapdal dykyzlyk kartasyny hasaplamak üçin ulanyldy. Keramidiň baýlaşma/ýokalma kartasyny almak üçin, Cer-iň dykyzlyk kartasy Cer we DOPC kartasynyň jemine bölünýär, soňra bolsa bedendäki Cer konsentrasiýasyna bölünýär. Şol bir reňk kartasynyň şkalasy ulanylýar.
Bu makala üçin goşmaça materiallar üçin şu salgy boýunça serediň: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Bu Creative Commons Attribution-Non-Commercial License şertlerine laýyklykda ýaýradylýan açyk girişli makala bolup, ol islendik serişdede ulanmaga, ýaýratmaga we köpeltmäge rugsat berýär, eger soňky ulanyş täjirçilik girdejisi üçin bolmasa we asyl işiň dogrudygy şerti bilen. Salgylanma.
Bellik: Sahypa maslahat berýän adamyň e-poçtany görmegini isleýändigiňizi we onuň spam däldigini bilmegi üçin diňe e-poçta salgyňyzy bermegiňizi haýyş edýäris. Biz hiç hili e-poçta salgylaryny hasaba almarys.
Bu sorag siziň myhmandygyňyzy barlamak we awtomatiki spam iberilmeginiň öňüni almak üçin ulanylýar.
Sofiýa Rodriges-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Kortez · Gomez (Alejandro Kortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Waleriýa Zoni (Waleria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Anailera-Romero Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miýako Riman (Miýako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D ýokary çözgütli real wagt suratlandyrmasy, selektiw çykyş ýerlerinde belogy sortlamak üçin keramid zynjyrynyň uzynlygynyň ähmiýetini açyp görkezýär.
Sofiýa Rodriges-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Kortez · Gomez (Alejandro Kortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Waleriýa Zoni (Waleria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Anailera-Romero Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miýako Riman (Miýako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D ýokary çözgütli real wagt suratlandyrmasy, selektiw çykyş ýerlerinde belogy sortlamak üçin keramid zynjyrynyň uzynlygynyň ähmiýetini açyp görkezýär.
© 2020 Ylmyň ösüşi üçin Amerikan birleşigi. ähli hukuklar goralandyr. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef we COUNTER-iň hyzmatdaşy. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.