Biz öň bagyr fibrozy bolan näsaglarda içegeden alynýan triptofan metaboliti indol-3-propion turşusynyň (IPA) gan plazmasyndaky derejesiniň pesdigini habar berdik. Bu gözlegde biz semiz bagyrlardaky transkriptomy we DNK metilomasyny gan plazmasyndaky IPA derejeleri bilen baglylykda, şeýle hem IPA-nyň in vitro bagyr ýyldyz öýjükleriniň (HSC) fenotipik inaktiwleşdirilmegini induksiýa etmekdäki roluny öwrendik.
Bu gözlege Kuopio Bariatrik Hirurgiýa Merkezinde (KOBS) bariatrik operasiýa geçirilen 2-nji tip diabet (T2DM) bolmadyk 116 semiz hassa (ýaşy 46,8 ± 9,3 ýaş; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) gatnaşdy. Syrlanýan IPA derejeleri suwuk hromatografiýa-mass spektrometriýasy (LC-MS) arkaly ölçeldi, bagryň transkriptom analizi umumy RNK yzygiderligi arkaly geçirildi we DNK metilleşme analizi Infinium HumanMethylation450 BeadChip ulanylyp geçirildi. In vitro synaglar üçin adam bagyr ýyldyz şekilli öýjükleri (LX-2) ulanyldy.
Syworotka IPA derejeleri bagyrdaky apoptoz, mitofagik we uzak ömürlilik ýollaryna gatnaşýan genleriň ekspresiýasy bilen baglanyşyklydy. AKT serin/treonin kinaz 1 (AKT1) geni bagyr transkriptinde we DNK metilleşme profillerinde iň köp we dominant özara täsirleşýän gen boldy. IPA bejergisi fibroz, apoptoz we LX-2 öýjükleriniň ýaşamagyny düzgünleşdirýändigi mälim bolan genleriň ekspresiýasyny modulirlemek arkaly apoptozy, mitohondrial dem alyşy peseldi we öýjük morfologiýasyny we mitohondrial dinamikany üýtgetdi.
Bu maglumatlar bilelikde IPA-nyň potensial terapewtiki täsirleriniň bardygyny we apoptozy döredip, HSC fenotipini işjeň däl ýagdaýa geçirip biljekdigini, şeýlelik bilen HSC-niň aktiwleşdirilmegine we mitohondrial metabolizmine päsgel bermek arkaly bagyr fibrozynyň öňüni almak mümkinçiligini giňeltýändigini goldaýar.
Semizligiň we metabolik sindromyň ýaýramagy metabolik taýdan baglanyşykly ýagly bagyr keseliniň (MASLD) artýan ýygylygy bilen baglanyşyklydyr; bu kesel umumy ilatyň 25% -den 30% -ine çenli täsir edýär [1]. MASLD etiologiýasynyň esasy netijesi bagyr fibrozydyr, bu bolsa süýümli hüjreara daşary matrisanyň (EKM) üznüksiz toplanmagy bilen häsiýetlendirilýän dinamiki prosesdir [2]. Bagyr fibrozyna gatnaşýan esasy hüjreler dört belli fenotipi görkezýän bagyr ýyldyz şekilli hüjreleridir (HSC-ler). HSC-ler aktiwleşdirilip we α-ýumşak myşsa aktiniň (α-SMA) we I görnüşli kollageniň (Col-I) ekspresiýasy artýan ýokary energiýa talap edýän proliferasiýa fibroblast ýaly hüjrelere transdifferensiasiýa edilip bilner [5, 6]. Bagyr fibrozynyň yzyna gaýtmak döwründe aktiwleşdirilen HSC-ler apoptoz ýa-da inaktiwasiýa arkaly ýok edilýär. Bu prosesler fibrogen genleriň peselmegini we prosurvival genleriň (meselem, NF-κB we PI3K/Akt signal ýollary) modulýasiýasyny [7, 8], şeýle hem mitohondrial dinamikadaky we funksiýasyndaky üýtgeşmeleri [9] öz içine alýar.
Içegede öndürilýän triptofan metaboliti indol-3-propion turşusynyň (IPA) gan plazmasyndaky derejesiniň MASLD ýaly adam metabolik kesellerinde peselýändigi anyklandy [10–13]. IPA iýmit süýümini kabul etmek bilen baglanyşyklydyr, antioksidant we iltihaba garşy täsirleri bilen tanalýar we iýmit sebäpli alkogolsyz steatohepatit (NASH) fenotipini in vivo we in vitro ýagdaýda gowşadýar [11–14]. Käbir subutnamalar biziň öňki gözlegimizden gelip çykýar, olar Kuopio Bariatrik Hirurgiýa Gözleginde (KOBS) bagyr fibrozy bolan näsaglarda bagyr fibrozy bolmadyk semiz näsaglara garanyňda gan plazmasyndaky IPA derejesiniň pesdigini görkezdi. Mundan başga-da, biz IPA bejergisiniň adam bagyr ýyldyz şekilli öýjük (LX-2) modelinde öýjükleriň ýapyşmagynyň, öýjükleriň göçmeginiň we gematopoetik kök öýjükleriniň aktiwleşdirilmeginiň klassiki alamatlary bolan we potensial gepatoprotektor metabolit bolan genleriň ekspresiýasyny azaldyp biljekdigini görkezdik [15]. Şeýle-de bolsa, IPA-nyň HSC apoptozyny we mitohondrial bioenergetikany işjeňleşdirmek arkaly bagyr fibrozynyň regressiýasyny nähili döredýändigi belli däl.
Bu ýerde biz semiz, ýöne 2-nji tip diabet (KOBS) bolmadyk adamlaryň bagrynda apoptoz, mitofagiýa we uzak ömür ýollary bilen baýlaşdyrylan genleriň ekspresiýasy bilen serum IPA-nyň baglanyşyklydygyny görkezýäris. Mundan başga-da, biz IPA-nyň işjeňleşdirilen gematopoetik kök öýjükleriniň (HSC) inaktiwasiýa ýoly arkaly arassalanmagyna we dargamagyna sebäp bolup biljekdigini anykladyk. Bu netijeler IPA-nyň täze roluny açyp görkezýär we ony bagyr fibrozynyň regressiýasyny höweslendirmek üçin potensial terapewtiki nyşana öwürýär.
KOBS kohortasynda öňki geçirilen gözlegde bagyr fibrozy bolan näsaglarda bagyr fibrozy bolmadyk näsaglara garanyňda aýlanýan IPA derejesiniň pesdigi görkezildi [15]. 2-nji görnüşli diabetiň mümkin bolan garyşdyryjy täsirini aradan aýyrmak üçin, biz dowam edýän KOBS gözleginden gözleg ilaty hökmünde 2-nji görnüşli diabeti bolmadyk 116 semiz näsagy (ortaça ýaş ± SD: 46,8 ± 9,3 ýaş; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1-nji tablisa) saýladyk [16]. Ähli gatnaşyjylar ýazmaça maglumatly razylyk berdiler we gözleg protokoly Helsinki Jarnamasyna (54/2005, 104/2008 we 27/2010) laýyklykda Demirgazyk Sawo okrugynyň hassahanasynyň Etika komiteti tarapyndan tassyklanyldy.
Bagyr biopsiýasynyň nusgalary bariatrik hirurgiýa wagtynda alyndy we tejribeli patologlar tarapyndan öň beýan edilen ölçeglere laýyklykda gistologik taýdan baha berildi [17, 18]. Baha beriş ölçegleri S1 goşmaça tablisasynda jemlenen we öň beýan edilen [19].
Açlyk syworotkasynyň nusgalary metabolomika seljermesi üçin maksatsyz suwuklyk hromatografiýasy-mass spektrometriýasy (LC-MS) arkaly seljerildi (n = 116). Nusgalar öň beýan edilişi ýaly UHPLC-qTOF-MS ulgamy (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germaniýa) ulanylyp seljerildi19. Izopropil spirtiniň (IPA) kesgitlenmegi saklanma wagtyna we MS/MS spektriniň arassa standartlar bilen deňeşdirilmegine esaslandy. IPA signalynyň intensiwligi (pik meýdany) ähli mundan beýläkki seljermelerde göz öňünde tutuldy [20].
Bagryň tutuş RNK yzygiderligi Illumina HiSeq 2500 ulanylyp geçirildi we maglumatlar öň beýan edilişi ýaly öňünden işlenildi [19, 21, 22]. Biz MitoMiner 4.0 maglumat bazasyndan saýlanan 1957 geni ulanyp, mitohondrial funksiýa/biogeneze täsir edýän transkriptleriň maksatly differensial ekspressiýa analizini geçirdik [23]. Bagryň DNK metilleşme analizi öň beýan edilişi ýaly usulyýet ulanyp Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ABŞ) ulanylyp geçirildi [24, 25].
Adam bagyrynyň ýyldyz şekilli öýjükleri (LX-2) professor Stefano Romeo tarapyndan berildi we DMEM/F12 gurşawynda (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) ösdürilip ýetişdirildi we saklandy. IPA-nyň iş dozasyny saýlamak üçin, LX-2 öýjükleri DMEM/F12 gurşawynda 24 sagatlap dürli konsentrasiýaly IPA (10 μM, 100 μM we 1 mM; Sigma, 220027) bilen işlenildi. Mundan başga-da, IPA-nyň HSC-leri işjeňsizleşdirmek ukybyny öwrenmek üçin, LX-2 öýjükleri 24 sagatlap syworotkasyz gurşawda 5 ng/ml TGF-β1 (R&D ulgamlary, 240-B-002/CF) we 1 mM IPA bilen bilelikde işlenildi. Degişli ulag gözegçiligi üçin, TGF-β1 bejergisi üçin 0,1% BSA saklaýan 4 nM HCL we IPA bejergisi üçin 0,05% DMSO ulanyldy we ikisi hem utgaşdyrylan bejergi üçin bilelikde ulanyldy.
Apoptoz öndürijiň görkezmelerine laýyklykda FITC Annexin V Apoptoz Detektiw Kit (Biolegend, San Diego, CA, ABŞ, Kat.# 640922) arkaly bahalandyryldy. Gysgaça aýdylanda, LX-2 (1 × 105 öýjük/guýuk) 12 guýulyk plastinkalarda bir gije ösdürilip ýetişdirildi we soňra IPA ýa-da IPA we TGF-β1-iň köp dozasy bilen işlenildi. Ertesi gün suwda ýüzýän we ýapyşýan öýjükler ýygnaldy, tripsinizleşdirildi, PBS bilen ýuwuldy, Annexin V baglaýjy buferinde gaýtadan suspenzasiýa edildi we FITC-Annexin V we 7-AAD bilen 15 minutlap inkubasiýa edildi.
Diri öýjüklerdäki mitohondriýalar oksidatiw işjeňlik üçin Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ulanyp boýaldy. MTR synaglary üçin LX-2 öýjükleri IPA we TGF-β1 bilen deň dykyzlykda inkubasiýa edildi. 24 sagatdan soň, diri öýjükler tripsinizleşdirildi, PBS bilen ýuwuldy we soňra öň beýan edilişi ýaly [26] 37 °C-de 20 minutlap syworotkasyz gurşawda 100 μM MTR bilen inkubasiýa edildi. Diri öýjük morfologiýasyny seljermek üçin öýjük ölçegleri we sitoplazmatik çylşyrymlylyk degişlilikde öňe tarap saçylma (FSC) we gapdal saçylma (SSC) parametrlerini ulanyp seljerildi.
Ähli maglumatlar (30,000 waka) NovoCyte Quanteon (Agilent) arkaly toplanyldy we NovoExpress® 1.4.1 ýa-da FlowJo V.10 programma üpjünçiligi arkaly seljerildi.
Kislorod sarp edilişiniň tizligi (OCR) we öýjük daşyndaky kislotalaşma tizligi (ECAR) öndürijiň görkezmelerine laýyklykda Seahorse XF Cell Mito Stress bilen enjamlaşdyrylan Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) arkaly real wagt režiminde ölçeldi. Gysgaça aýdylanda, 2 × 104 LX-2 öýjük / guýu XF96 öýjük medeniýeti plastinkalaryna ekildi. Gije inkubasiýasyndan soň, öýjükler izopropanol (IPA) we TGF-β1 (Goşmaça usullar 1) bilen işlenildi. Maglumatlaryň seljermesi Seahorse XF Cell Energy Fenotip synag hasabatynyň generatoryny öz içine alýan Seahorse XF Wave programma üpjünçiligi arkaly geçirildi. Mundan bioenergetik saglyk indeksi (BHI) hasaplandy [27].
Umumy RNK kDNK-a transkripsiýa edildi. Aýratyn usullar üçin [15] salgylanmasyna serediň. Adamyň 60S ribosomal kislotaly belogy P0 (RPLP0) we siklofilin A1 (PPIA) mRNK derejeleri esasy gen gözegçiligi hökmünde ulanyldy. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR ulgamy (Thermo Fisher, Landsmeer, Niderlandlar) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ýa-da Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) bilen ulanyldy we gen ekspresiýasynyň deňeşdirme gatlagy deňeşdirme Ct gymmatynyň sikl parametrleri (ΔΔCt) we ∆∆Ct usuly arkaly hasaplanyldy. Primerleriň jikme-jiklikleri S2 we S3 goşmaça tablisalarynda berilýär.
Ýadro DNK-sy (ncDNA) we mitohondrial DNK-sy (mtDNA) öň beýan edilişi ýaly [28] DNeasy gan we dokuma toplumy (Qiagen) ulanylyp alyndy. MtDNA-nyň deňeşdirme mukdary, Goşmaça usullar 2-de jikme-jik beýan edilişi ýaly, her bir nyşana mtDNA sebitiniň üç ýadro DNK sebitiniň (mtDNA/ncDNA) geometrik ortaça bahasyna gatnaşygyny hasaplamak arkaly hasaplandy. MtDNA we ncDNA üçin primerleriň jikme-jiklikleri Goşmaça S4 tablisasynda berilýär.
Öýjükara we öýjük içi mitohondrial torlary wizuallaşdyrmak üçin diri öýjükler Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) bilen boýaldy. LX-2 öýjükleri (1 × 104 öýjük/guýuk) degişli aýna düýbi bolan medeniýet plastinkalaryndaky aýna slaýdlarynda (Ibidi GmbH, Martinsried, Germaniýa) ösdürilip ýetişdirildi. 24 sagatdan soň, diri LX-2 öýjükleri 37 °C-da 20 minutlap 100 μM MTR bilen inkubasiýa edildi we öýjük ýadrolary öň beýan edilişi ýaly DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) bilen boýaldy [29]. Mitohondrial torlar 37 °C-da 5% CO2 bilen çygly atmosferada 63 × NA 1.3 obýektiw ulanyp, Zeiss LSM 800 konfokal moduly bilen enjamlaşdyrylan Zeiss Axio Observer ters mikroskopy (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germaniýa) arkaly wizuallaşdyryldy. Her nusga görnüşi üçin on sany Z-seriýaly surat aldyk. Her Z-seriýasynda her biriniň galyňlygy 9,86 μm bolan 30 bölek bar. Her nusga üçin ZEN 2009 programma üpjünçiligi (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germaniýa) ulanylyp, on sany dürli görüş meýdanynyň suratlary alyndy we mitohondrial morfologiýa seljermesi Goşmaça usullar 3-de jikme-jik görkezilen parametrlere laýyklykda ImageJ programma üpjünçiligi (v1.54d) [30, 31] ulanylyp geçirildi.
Öýjükler 0,1 M fosfat buferinde 2% glutaraldegid bilen berkidildi, soňra 1% osmiý tetroksid ergini (Sigma Aldrich, MO, ABŞ) bilen berkidildi, aseton bilen ýuwaş-ýuwaşdan guradyldy (Merck, Darmstadt, Germaniýa) we ahyrsoňy epoksid smolasyna goýuldy. Ultra inçe kesikler taýýarlanyldy we 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Germaniýa) we 1% gurşun sitrat (Merck, Darmstadt, Germaniýa) bilen boýaldy. Ultrastruktur suratlar 80 kV tizleşdiriji naprýaženiýede JEM 2100F EXII geçiriji elektron mikroskopy (JEOL Ltd, Tokio, Ýaponiýa) arkaly alyndy.
24 sagatlap IPA bilen bejerilen LX-2 öýjükleriniň morfologiýasy Zeiss ters yşyk mikroskopy (Zeiss Axio Vert.A1 we AxioCam MRm, Ýena, Germaniýa) ulanylyp, 50 esse ulaldylan faza-kontrast mikroskopiýa arkaly seljerildi.
Kliniki maglumatlar ortaça ± standart çetleşme ýa-da mediana (kwartil aralygy: IQR) hökmünde görkezildi. Üç gözleg toparynyň arasyndaky tapawutlary deňeşdirmek üçin birtaraplaýyn dispersiýa analizi (üznüksiz üýtgeýänler) ýa-da χ² synagy (kategoriki üýtgeýänler) ulanyldy. Köp sanly synaglary düzetmek üçin ýalňyş pozitiw tizlik (FDR) ulanyldy we FDR < 0,05 bolan genler statistik taýdan ähmiýetli hasaplandy. CpG DNK metilleşmesini IPA signalynyň intensiwligi bilen baglanyşdyrmak üçin Spirman korrelasiýa analizi ulanyldy, nominal p gymmatlyklary (p < 0,05) habar berildi.
Ýol analizi 268 transkript (nominal p < 0.01), mitohondriýa bilen baglanyşykly 119 transkript (nominal p < 0.05) we aýlanýan gan serum IPA derejeleri bilen baglanyşykly 3093 bagyr transkriptinden 4350 CpG üçin web esasly gen toplumyny analiz etmek guraly (WebGestalt) arkaly geçirildi. Erkin elýeterli Venny DB (2.1.0 wersiýasy) guraly üst-üste düşýän genleri tapmak üçin ulanyldy we StringDB (11.5 wersiýasy) belok-belok özara täsirlerini wizuallaşdyrmak üçin ulanyldy.
LX-2 tejribesi üçin nusgalar D'Agostino-Pearson synagy arkaly kadalylygy barlanyldy. Maglumatlar azyndan üç biologik gaýtalamalardan alyndy we Bonferroni post-hoc synagy bilen birtaraplaýyn ANOVA-a sezewar edildi. 0,05-den az p-bahasy statistik taýdan ähmiýetli hasaplandy. Maglumatlar ortaça ± SD hökmünde görkezilýär we her bir suratda synaglaryň sany görkezilýär. Ähli seljermeler we grafikler Windows üçin GraphPad Prism 8 statistik programma üpjünçiligini (GraphPad Software Inc., 8.4.3 wersiýasy, San-Diego, ABŞ) ulanyp geçirildi.
Ilki bilen, biz syworotka IPA derejeleriniň bagyr, tutuş beden we mitohondrial transkriptler bilen baglanyşygyny öwrendik. Umumy transkript profilinde syworotka IPA derejeleri bilen baglanyşykly iň güýçli gen MAPKAPK3 boldy (FDR = 0.0077; mitogen bilen aktiwleşdirilen protein kinaza bilen aktiwleşdirilen protein kinaza 3); mitohondriýa bilen baglanyşykly transkript profilinde iň güýçli baglanyşykly gen AKT1 boldy (FDR = 0.7621; AKT serin/treonin kinaza 1) (Goşmaça faýl 1 we Goşmaça faýl 2).
Soňra global transkriptleri (n = 268; p < 0.01) we mitohondriýa bilen baglanyşykly transkriptleri (n = 119; p < 0.05) seljerdik, netijede apoptozy iň möhüm kanonik ýol hökmünde kesgitledik (p = 0.0089). Serum IPA derejeleri bilen baglanyşykly mitohondrial transkriptler üçin biz apoptoza (FDR = 0.00001), mitofagiýa (FDR = 0.00029) we TNF signal ýollaryna (FDR = 0.000006) üns berdik (1A surat, 2-nji tablisa we goşmaça 1A-B suratlar).
Adam bagrynda global, mitohondriýa bilen baglanyşykly transkriptleriň we DNK metilleşmesiniň serum IPA derejeleri bilen baglanyşykly üst-üste düşýän analizi. A serum IPA derejeleri bilen baglanyşykly 3092 CpG ýerlerine kartalaşdyrylan 268 global transkripti, 119 mitohondriýa bilen baglanyşykly transkripti we DNK metilleşdirilen transkripti görkezýär (p gymmatlyklary global transkriptler we metilleşdirilen DNK üçin < 0.01 we p gymmatlyklary mitohondriýa transkriptleri üçin < 0.05). Esasy üst-üste düşýän transkriptler ortada görkezilen (AKT1 we YKT6). B Iň ýokary özara täsir baly (0.900) bolan 13 geniň beýleki genler bilen özara täsirleşme kartasy StringDB onlaýn guralyny ulanyp, serum IPA derejeleri bilen düýpli baglanyşykly bolan 56 üst-üste düşýän genlerden (gara çyzyk sebiti) guruldy. Ýaşyl: Gen Ontologiýasy (GO) öýjük bölegine kartalaşdyrylan genler: mitohondriýalar (GO:0005739). AKT1 maglumatlara esaslanyp (tekst gözlegine, tejribelere, maglumat bazalaryna we bilelikde beýan edilişine esaslanyp) beýleki beloklar bilen özara täsirleşmekde iň ýokary bal alan (0.900) belokdyr. Tor düwünleri beloklary, gyralar bolsa beloklaryň arasyndaky baglanyşygy görkezýär.
Içege mikrobiota metabolitleri epigenetik düzümi DNK metilleşmesi arkaly düzgünleşdirip bilýändigi üçin [32], biz gan plazmasyndaky IPA derejesiniň bagyr DNK metilleşmesi bilen baglanyşyklydygyny ýa-da baglanyşykly däldigini öwrendik. Biz gan plazmasyndaky IPA derejeleri bilen baglanyşykly iki esasy metilleşme ýeriniň prolin-serine baý sebit 3 (C19orf55) we ýylylyk şok belogy maşgalasy B (kiçi) agzasy 6 (HSPB6) golaýyndadygyny anykladyk (Goşmaça faýl 3). 4350 CpG-niň DNK metilleşmesi (p < 0.01) gan plazmasyndaky IPA derejeleri bilen baglanyşyklydy we uzak ömürliligi düzgünleşdirýän ýollar bilen baýlaşdyryldy (p = 0.006) (1A surat, 2-nji tablisa we Goşmaça 1C surat).
Adam bagrynda syworotka IPA derejeleri, global transkriptler, mitohondriýa bilen baglanyşykly transkriptler we DNK metilleşmesi arasyndaky baglanyşygyň esasynda duran biologik mehanizmleri düşünmek üçin, öňki ýol analizinde kesgitlenen genleriň üst-üst analizini geçirdik (1A surat). Üst-üst bolýan 56 geniň (1A suratdaky gara çyzygyň içinde) ýol baýlaşdyryş analiziniň netijeleri apoptoz ýolunyň (p = 0.00029) üç analiz üçin umumy bolan iki geni: AKT1 we YKT6 (YKT6 v-SNARE gomology), Wenn diagrammasynda görkezilişi ýaly görkezdi (Goşmaça surat 2 we 1A surat). Gyzykly tarapy, AKT1 (cg19831386) we YKT6 (cg24161647) syworotka IPA derejeleri bilen oňyn baglanyşyklydygyny anykladyk (Goşmaça faýl 3). Gen önümleriniň arasyndaky mümkin bolan belok özara täsirlerini kesgitlemek üçin, giriş hökmünde 56 üst-üst bolýan genleriň arasynda iň ýokary umumy sebit baly (0.900) bolan 13 geni saýladyk we özara täsir kartasyny düzdik. Ynamlylyk derejesine (marjinal ynam) görä, iň ýokary bal (0.900) alan AKT1 geni iň ýokary orunda durdy (1B surat).
Ýol seljermesine esaslanyp, biz apoptozyň esasy ýol bolandygyny anykladyk, şonuň üçin IPA bejergisiniň in vitro HSC-leriň apoptozyna täsir edip-etmejekdigini öwrendik. Öň IPA-nyň dürli dozalarynyň (10 μM, 100 μM we 1 mM) LX-2 öýjükleri üçin zäherli däldigini görkezdik [15]. Bu gözleg 10 μM we 100 μM-de IPA bejergisiniň ýaşaýyş ukybyna eýe we nekrotik öýjükleriň sanyny köpeltdigini görkezdi. Şeýle-de bolsa, gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, öýjük ýaşaýyş ukyby 1 mM IPA konsentrasiýasynda peseldi, öýjük nekroz tizligi bolsa üýtgewsiz galdy (2A, B surat). Soňra, LX-2 öýjüklerinde apoptozy döretmek üçin iň amatly konsentrasiýany tapmak üçin, biz 24 sagatlap 10 μM, 100 μM we 1 mM IPA synagdan geçirdik (2A-E surat we Goşmaça 3A-B surat). Gyzykly tarapy, IPA 10 μM we 100 μM apoptoz tizligini (%) peseltdi, ýöne IPA 1 mM gözegçilik toparyna garanyňda giçki apoptoz we apoptoz tizligini (%) ýokarlandyrdy we şonuň üçin mundan beýläkki tejribeler üçin saýlandy (2A–D suratlar).
IPA LX-2 öýjükleriniň apoptozyny döredýär. Apoptoz tizligini we öýjük morfologiýasyny akym sitometriýasy arkaly kesgitlemek üçin Annexin V we 7-AAD goşa boýamak usuly ulanyldy. BA öýjükleri 24 sagatlap 10 μM, 100 μM we 1 mM IPA bilen ýa-da 24 sagatlap serumsyz gurşawda F–H TGF-β1 (5 ng/ml) we 1 mM IPA bilen inkubasiýa edildi. A: diri öýjükler (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotik öýjükler (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: irki (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: giçki (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptoz tizligindäki irki we giçki apoptoz öýjükleriniň umumy göterimi (%). Maglumatlar ortaça ± SD, n = 3 garaşsyz tejribe hökmünde görkezilýär. Statistik deňeşdirmeler birtaraplaýyn ANOVA we Bonferroni post hoc synagy ulanylyp geçirildi. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Öň görkezşimiz ýaly, 5 ng/ml TGF-β1 klassiki marker genleriniň ekspresiýasyny ýokarlandyrmak arkaly HSC aktiwleşdirmesini döredip biler [15]. LX-2 öýjükleri 5 ng/ml TGF-β1 we 1 mM IPA bilen utgaşdyrylyp bejerildi (2E–H surat). TGF-β1 bejergisi apoptoz tizligini üýtgetmedi, ýöne IPA bilen bilelikde bejergi TGF-β1 bejergisi bilen deňeşdirilende giçki apoptozy we apoptoz tizligini (%) ýokarlandyrdy (2E–H surat). Bu netijeler 1 mM IPA-nyň TGF-β1 induksiýasyndan garaşsyz LX-2 öýjüklerinde apoptozy höweslendirip biljekdigini görkezýär.
Biz IPA-nyň LX-2 öýjüklerinde mitohondrial dem alyşyna täsirini has giňişleýin öwrendik. Netijeler 1 mM IPA-nyň kislorod sarp edilişiniň tizliginiň (OCR) parametrlerini: mitohondrial däl dem alyşy, bazal we maksimal dem alyşy, proton syzmagyny we ATF önümçiligini gözegçilik topary bilen deňeşdirilende (3A, B surat) peseldendigini, bioenergetik saglyk indeksiniň (BHI) bolsa üýtgemedigini görkezdi.
IPA LX-2 öýjüklerinde mitohondrial dem alyşyny azaldýar. Mitohondrial dem alyş egrisi (OCR) mitohondrial dem alyş parametrleri (mitohondrial däl dem alyş, bazal dem alyş, maksimal dem alyş, proton syzmasy, ATP döremegi, SRC we BHI) hökmünde görkezilýär. A we B öýjükleri degişlilikde 24 sagatlap 10 μM, 100 μM we 1 mM IPA bilen inkubasiýa edildi. C we D öýjükleri degişlilikde 24 sagatlap syworotkasyz gurşawda TGF-β1 (5 ng/ml) we 1 mM IPA bilen inkubasiýa edildi. Ähli ölçegler CyQuant toplumyny ulanyp DNK mazmunyna kadalaşdyryldy. BHI: bioenergetik saglyk indeksi; SRC: dem alyş ätiýaçlyk kuwwaty; OCR: kislorod sarp edilişiniň tizligi. Maglumatlar ortaça ± standart çetleşme (SD), n = 5 garaşsyz tejribe hökmünde görkezilýär. Statistik deňeşdirmeler bir taraply ANOVA we Bonferroni post hoc synagy arkaly geçirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; we ***p < 0.001
TGF-β1 bilen aktiwleşdirilen LX-2 öýjükleriniň bioenergetik profiline IPA-nyň täsirini has giňişleýin düşünmek üçin, biz OCR arkaly mitohondrial oksidatiw fosforlaşmany seljerdik (3C, D surat). Netijeler TGF-β1 bejergisiniň gözegçilik topary bilen deňeşdirilende iň ýokary dem alyş, dem alyş ätiýaçlyk kuwwatyny (SRC) we BHI-ni azaldyp biljekdigini görkezdi (3C, D surat). Mundan başga-da, utgaşdyrylan bejergi bazal dem alyşyny, proton syzmagyny we ATP önümçiligini azaldy, ýöne SRC we BHI TGF-β1 bilen bejerilenlerden has ýokarydy (3C, D surat).
Şeýle hem, biz Seahorse programma üpjünçiligi tarapyndan berlen "Öýjük energiýasy fenotip synagyny" geçirdik (Goşmaça surat 4A–D). Goşmaça surat 3B-de görkezilişi ýaly, TGF-β1 bejergisinden soň OCR we ECAR metabolik potensialy peseldi, ýöne gözegçilik topary bilen deňeşdirilende kombinasiýa we IPA bejergi toparlarynda hiç hili tapawut görülmedi. Mundan başga-da, kombinasiýa we IPA bejergisinden soň OCR-iň bazal we stress derejeleri gözegçilik topary bilen deňeşdirilende peseldi (Goşmaça surat 4C). Gyzykly tarapy, kombinasiýa terapiýasy bilen meňzeş ýagdaý syn edildi, bu ýerde TGF-β1 bejergisi bilen deňeşdirilende ECAR-iň bazal we stress derejelerinde hiç hili üýtgeşiklik görülmedi (Goşmaça surat 4C). HSC-lerde mitohondrial oksidatiw fosforilleşmesiniň peselmegi we kombinasiýa bejergisiniň TGF-β1 bejergisine sezewar bolandan soň SCR we BHI-ni dikeltmek ukyby metabolik potensialy üýtgetmedi (OCR we ECAR). Bu netijeler bilelikde alnanda, IPA-nyň HSC-lerde bioenergetikany peseldip biljekdigini görkezýär, bu bolsa IPA-nyň HSC fenotipini inaktiwleşdirmäge tarap süýşürýän pes energiýa profilini döredip biljekdigini görkezýär (Goşmaça surat 4D).
IPA-nyň mitohondrial dinamikasyna täsiri mitohondrial morfologiýanyň we tor birikmeleriniň üç ölçegli mukdaryny kesgitlemek, şeýle hem MTR boýagy arkaly öwrenildi (4-nji surat we 5-nji goşmaça surat). 4-nji suratda gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, TGF-β1 bejergisiniň ortaça ýüz meýdanyny, şaha sanyny, şahalaryň umumy uzynlygyny we şahalaryň birleşme sanyny azaltandygy (4A we B suratlar) we mitohondriallaryň paýyny sferikiden orta morfologiýa üýtgedendigi görkezilýär (4C surat). Diňe IPA bejergisi gözegçilik topary bilen deňeşdirilende ortaça mitohondrial göwrümi azaltdy we mitohondriallaryň paýyny sferikiden orta morfologiýa üýtgedendigi görkezilýär (4A surat). Tersine, mitohondrial membrananyň potensialyna bagly MTR (4A we E suratlar) arkaly bahalandyrylan sferikilik, şahalaryň ortaça uzynlygy we mitohondrial işjeňlik üýtgewsiz galdy we bu parametrler toparlar arasynda tapawutlanmady. Jemi alnanda, bu netijeler TGF-β1 we IPA bejergisiniň diri LX-2 öýjüklerinde mitohondrial görnüşi we ölçegini, şeýle hem tor çylşyrymlylygyny modulirleýän ýaly görünýändigini görkezýär.
IPA LX-2 öýjüklerinde mitohondrial dinamikany we mitohondrial DNK-nyň köplügini üýtgedýär. A. TGF-β1 (5 ng/ml) we 1 mM IPA bilen 24 sagatlap syworotkasyz gurşawda inkubasiýa edilen diri LX-2 öýjükleriniň wekilçilikli konfokal suratlary, Mitotracker™ Gyzyl CMXRos bilen boýalan mitohondrial torlary we DAPI bilen gök reňke boýalan ýadrolary görkezýär. Ähli maglumatlar her topar üçin azyndan 15 suraty öz içine alýardy. Her nusga görnüşi üçin 10 Z-stek suratyny aldyk. Her Z-okunyň yzygiderliligi 30 dilimden ybaratdy, her biri 9,86 μm galyňlykda. Ölçeg çyzygy: 10 μm. B. Surata uýgunlaşma bosagasyny ulanmak arkaly kesgitlenen wekilçilikli obýektler (diňe mitohondrial). Her topardaky ähli öýjükler üçin mitohondrial morfologiki tor baglanyşyklarynyň mukdary seljermesi we deňeşdirmesi geçirildi. C. Mitohondrial şekil gatnaşyklarynyň ýygylygy. 0-a golaý gymmatlyklar sferiki şekilleri, 1-e golaý gymmatlyklar bolsa filament şekillerini görkezýär. D Mitohondrial DNK-nyň (mtDNK) mazmuny Materiallar we usullar bölüminde beýan edilişi ýaly kesgitlenildi. E Mitotracker™ Gyzyl CMXRos analizi Materiallar we usullar bölüminde beýan edilişi ýaly akym sitometriýasy (30,000 waka) arkaly geçirildi. Maglumatlar ortaça ± SD, n = 3 garaşsyz tejribe hökmünde görkezilýär. Statistik deňeşdirmeler bir taraplaýyn ANOVA we Bonferroni post hoc synagy arkaly geçirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Soňra biz LX-2 öýjüklerinde mtDNK-nyň mukdaryny mitohondrial sanynyň görkezijisi hökmünde seljerdik. Gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, TGF-β1 bilen bejerilen toparda mtDNK-nyň mukdary ýokarlandy (4D surat). TGF-β1 bilen bejerilen topar bilen deňeşdirilende, kombinasiýa edilen bejeriş toparynda mtDNK-nyň mukdary azaldy (4D surat), bu bolsa IPA-nyň mtDNK-nyň mukdaryny we mümkin mitohondrial sanyny, şeýle hem mitohondrial dem alyşyny azaldyp biljekdigini görkezýär (3C surat). Mundan başga-da, IPA kombinasiýa edilen bejerişde mtDNK-nyň mukdaryny azaldýan ýalydy, ýöne MTR arkaly mitohondrial işjeňlige täsir etmedi (4A–C suratlar).
Biz IPA-nyň LX-2 öýjüklerinde fibroz, apoptoz, diri galmak we mitohondrial dinamika bilen baglanyşykly genleriň mRNA derejeleri bilen baglanyşygyny öwrendik (5A–D surat). Gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, TGF-β1 bilen bejerilen toparda I görnüşli kollagen α2 zynjyry (COL1A2), α-ýumşak myşsa aktin (αSMA), matrisa metalloproteinaza 2 (MMP2), metalloproteinaza 1-iň dokuma ingibitory (TIMP1) we dinamin 1-e meňzeş gen (DRP1) ýaly genleriň ekspresiýasynyň ýokarlanandygy görkezildi, bu bolsa fibrozyň we aktiwleşmegiň ýokarlanandygyny görkezýär. Mundan başga-da, gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, TGF-β1 bejergisi ýadro pregnan X reseptorynyň (PXR), kaspaza 8-iň (CASP8), MAPKAPK3-iň, B-öýjük α-nyň ingibitorynyň, ýadro faktory κ geniniň ýeňil peptidiniň güýçlendirijisiniň (NFκB1A) we ýadro faktory κB kinazasynyň β-nyň ingibitorynyň (IKBKB) mRNA derejelerini peseltdi (5A–D surat). TGF-β1 bejergisi bilen deňeşdirilende, TGF-β1 we IPA bilen utgaşdyrylan bejergi COL1A2 we MMP2 ekspresiýasyny azaldy, ýöne PXR, TIMP1, B-hüjre limfomasy-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β we IKBKB-niň mRNA derejesini ýokarlandyrdy. IPA bejergisi MMP2, Bcl-2 bilen baglanyşykly belok X (BAX), AKT1, optiki atrofiýa belogy 1 (OPA1) we mitohondrial birleşme belogy 2 (MFN2) ekspresiýasyny ep-esli azaldy, CASP8, NFκB1A, NFκB1B we IKBKB ekspresiýasy bolsa gözegçilik topary bilen deňeşdirilende ýokarlandy. Şeýle-de bolsa, kaspaza-3 (CASP3), apoptotik peptidaza aktiwleşdiriji faktor 1 (APAF1), mitohondrial birleşme belogy 1 (MFN1) we bölünme belogy 1 (FIS1) ekspresiýasynda hiç hili tapawut tapylmady. Bu netijeler umumylykda IPA bejergisiniň fibroz, apoptoz, diri galmak we mitohondrial dinamika bilen baglanyşykly genleriň ekspresiýasyny modulirleýändigini görkezýär. Biziň maglumatlarymyz IPA bejergisiniň LX-2 öýjüklerinde fibrozy azaldýandygyny görkezýär; şol bir wagtyň özünde, fenotipi inaktiwleşdirmäge tarap üýtgetmek arkaly diri galmagy höweslendirýär.
IPA LX-2 öýjüklerinde fibroblast, apoptotik, ýaşaýyş ukyby we mitohondrial dinamika genleriniň ekspresiýasyny modulirleýär. Gistogrammalar LX-2 öýjükleri TGF-β1 we IPA bilen 24 sagatlap serumsyz gurşawda induksiýa edilenden soň, endogen gözegçilik (RPLP0 ýa-da PPIA) bilen deňeşdirilende mRNA ekspresiýasyny görkezýär. A fibroblastlary, B apoptotik öýjükleri, C diri galan öýjükleri we D mitohondrial dinamika geniniň ekspresiýasyny görkezýär. Maglumatlar ortaça ± standart çetleşme (SD), n = 3 garaşsyz tejribe hökmünde görkezilýär. Statistik deňeşdirmeler bir taraply ANOVA we Bonferroni post hoc synagy arkaly geçirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Soňra, öýjük ölçegindäki üýtgeşmeler (FSC-H) we sitoplazmatik çylşyrymlylyk (SSC-H) akym sitometriýasy arkaly bahalandyryldy (6A, B surat), IPA bejergisinden soň öýjük morfologiýasyndaky üýtgeşmeler bolsa geçirijilik elektron mikroskopiýasy (TEM) we faza kontrast mikroskopiýasy arkaly bahalandyryldy (Goşmaça surat 6A-B). Garaşylyşy ýaly, TGF-β1 bilen bejerilen topardaky öýjükler gözegçilik toparyna garanda ölçegleri boýunça ulaldy (6A, B surat), bu bolsa gödek endoplazmatik retikulumyň (ER*) we fagolizosomalaryň (P) klassiki giňelmegini görkezýär, bu bolsa gematopoetik kök öýjükleriň (HSC) aktiwleşmesini görkezýär (Goşmaça surat 6A). Şeýle-de bolsa, TGF-β1 bilen bejerilen topar bilen deňeşdirilende, TGF-β1 we IPA utgaşdyrylan bejergi toparynda öýjük ölçegi, sitoplazmatik çylşyrymlylyk (6A, B surat) we ER* mukdary azaldy (Goşmaça surat 6A). Mundan başga-da, IPA bejergisi gözegçilik topary bilen deňeşdirilende öýjükleriň ululygyny, sitoplazmatik çylşyrymlylygy (6A, B suratlar), P we ER* mukdaryny (Goşmaça 6A surat) azaldy. Mundan başga-da, gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, IPA bejergisiniň 24 sagadyndan soň apoptotik öýjükleriň mukdary ýokarlandy (ak ok, Goşmaça 6B surat). Umuman alanyňda, bu netijeler 1 mM IPA-nyň HSC apoptozyny höweslendirip we TGF-β1 tarapyndan döredilen öýjük morfologiki parametrlerinde üýtgeşmeleri yzyna gaýtaryp biljekdigini, şeýlelik bilen öýjükleriň ululygyny we çylşyrymlylygyny düzgünleşdirip biljekdigini görkezýär, bu bolsa HSC-niň işjeňsizleşdirilmegi bilen baglanyşykly bolup biler.
IPA LX-2 öýjüklerinde öýjük ölçegini we sitoplazmatiki çylşyrymlylygy üýtgedýär. Akym sitometriýasynyň seljermesiniň wekilçilikli suratlary. Seljermede LX-2 öýjükleri üçin aýratyn derweze strategiýasy ulanyldy: öýjük populýasiýasyny kesgitlemek üçin SSC-A/FSC-A, dubletleri kesgitlemek üçin FSC-H/FSC-A we öýjük ölçegini we çylşyrymlylygy seljermek üçin SSC-H/FSC-H. Öýjükler TGF-β1 (5 ng/ml) we 1 mM IPA bilen 24 sagatlap syworotkasyz gurşawda inkubasiýa edildi. LX-2 öýjükleri öýjük ölçegini we sitoplazmatiki çylşyrymlylygy seljermek üçin aşaky çep kwadrant (SSC-H-/FSC-H-), ýokarky çep kwadrant (SSC-H+/FSC-H-), aşaky sag kwadrant (SSC-H-/FSC-H+) we ýokarky sag kwadrant (SSC-H+/FSC-H+) bölündi. B. Öýjük morfologiýasy FSC-H (öňe tarap ýaýramak, öýjük ölçegi) we SSC-H (ýan tarap ýaýramak, sitoplazmatik çylşyrymlylyk) (30,000 waka) ulanyp, akym sitometriýasy arkaly seljerildi. Maglumatlar ortaça ± SD, n = 3 garaşsyz tejribe hökmünde görkezilýär. Statistik deňeşdirmeler birtaraplaýyn ANOVA we Bonferroni post hoc synagy arkaly geçirildi. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 we ****p < 0.0001
IPA ýaly içege metabolitleri ylmy barlaglaryň gyzgyn temasyna öwrüldi, bu bolsa içege mikrobiotasynda täze nyşanalaryň tapylyp biljekdigini görkezýär. Şonuň üçin, adamlarda bagyr fibrozy bilen baglanyşdyran metabolitimiz bolan IPA-nyň [15] haýwan modellerinde potensial antifibrotik birleşme bolandygy görkezilmegi gyzyklydyr [13, 14]. Bu ýerde biz ilkinji gezek 2-nji tip diabet (T2D) bolmadyk semiz adamlarda syworotka IPA bilen global bagyr transkriptomikasy we DNK metilleşmesi arasyndaky baglanyşygy görkezýäris, apoptozy, mitofagiýa we uzak ömürliligi, şeýle hem bagyr gomeostazyny düzgünleşdirýän mümkin bolan dalaşgär AKT1 genini görkezýäris. Barlaglarymyzyň ýene bir täzeligi, IPA bejergisiniň apoptoz, öýjük morfologiýasy, mitohondrial bioenergiýa we LX-2 öýjüklerinde dinamika bilen özara täsirini görkezendigimizdir, bu bolsa HSC fenotipini inaktiwleşdirmäge tarap süýşürýän pes energiýa spektrini görkezýär we IPA-ny bagyr fibrozyny gowulandyrmak üçin mümkin bolan dalaşgär edýär.
Biz apoptozyň, mitofagiýanyň we uzak ömürliligiň aýlanýan syworotka IPA bilen baglanyşykly bagyr genlerinde baýlaşdyrylan iň möhüm kanonik ýollardygyny anykladyk. Mitohondrial hil gözegçiligi (MQC) ulgamynyň bozulmagy mitohondrial disfunksiýa, mitofagiýa we apoptoza getirip, şeýdip MASLD-niň ýüze çykmagyna itergi berip biler [33, 34]. Şonuň üçin IPA-nyň bagyrda apoptoz, mitofagiýa we uzak ömürlilik arkaly öýjük dinamikasyny we mitohondrial bitewüligi saklamaga gatnaşyp biljekdigini çaklap bileris. Maglumatlarymyz üç synagda iki geniň umumydygyny görkezdi: YKT6 we AKT1. YKT6-nyň öýjük membranasynyň birleşme prosesine gatnaşýan SNARE belogydygyny bellemek gerek. Ol awtofagosomada STX17 we SNAP29 bilen başlangyç kompleksi emele getirmek arkaly awtofagiýada we mitofagiýada rol oýnaýar we şeýdip awtofagosomalaryň we lizosomalaryň birleşmesini höweslendirýär [35]. Mundan başga-da, YKT6 funksiýasynyň ýitmegi mitofagiýanyň bozulmagyna getirýär[36], YKT6-nyň ýokarlanmagy bolsa gepatosellüler karsinomanyň (HCC) ösmegi bilen baglanyşykly bolup, öýjükleriň ýaşaýşynyň ýokarlanýandygyny görkezýär[37]. Beýleki tarapdan, AKT1 iň möhüm özara täsirleşýän gen bolup, PI3K/AKT signallaşdyrma ýoluny, öýjük siklini, öýjükleriň göçmegini, köpelmegini, fokus adgeziýasyny, mitohondrial funksiýany we kollagen bölünip çykmagyny öz içine alýan bagyr kesellerinde möhüm rol oýnaýar[38–40]. Aktiwleşdirilen PI3K/AKT signallaşdyrma ýoly öýjük daşyndaky matrisanyň (ECM) öndürilmegi üçin jogapkär öýjükler bolan gematopoetik kök öýjüklerini (HSC) işjeňleşdirip biler we onuň bozulmagy bagyr fibrozynyň ýüze çykmagyna we ösmegine goşant goşup biler[40]. Mundan başga-da, AKT p53-garaşly öýjük apoptozynyň öňüni alýan öýjükleriň ýaşaýşynyň esasy faktorlarynyň biridir we AKT-niň işjeňleşdirilmegi bagyr öýjükleriniň apoptozynyň öňüni almak bilen baglanyşykly bolup biler[41, 42]. Alnan netijeler IPA-nyň apoptoza girmek ýa-da diri galmak arasyndaky gepatositleriň kararyna täsir etmek arkaly bagyr mitohondriýalary bilen baglanyşykly apoptoza gatnaşyp biljekdigini görkezýär. Bu täsirler bagyr gomeostazy üçin möhüm bolan AKT we/ýa-da YKT6 kandidat genleri tarapyndan düzgünleşdirilip bilner.
Netijelerimiz 1 mM IPA-nyň TGF-β1 bejergisinden garaşsyz LX-2 öýjüklerinde apoptozy we mitohondrial dem alyşy peseldendigini görkezdi. Apoptozyň fibrozyň çözülmegi we gematopoetik kök öýjükleriniň (HSC) işjeňleşdirilmegi üçin esasy ýol bolup, şeýle hem bagyr fibrozynyň gaýtaryp bolýan fiziologiki jogabynda esasy waka bolup durýandygyny bellemek gerek [4, 43]. Mundan başga-da, utgaşdyrylan bejergiden soň LX-2 öýjüklerinde BHI-niň dikeldilmegi IPA-nyň mitohondrial bioenergetikanyň düzgünleşdirilmegindäki mümkin bolan roluna täze düşünjeler berdi. Dynç alyş we işjeň däl şertlerde gematopoetik öýjükler adatça ATF öndürmek üçin mitohondrial oksidatiw fosforilleşmeden peýdalanýarlar we metabolik işjeňligi pes bolýarlar. Beýleki tarapdan, HSC-niň işjeňleşdirilmegi glikolitik ýagdaýa girmegiň energiýa zerurlyklaryny kompensasiýa etmek üçin mitohondrial dem alyşy we biosintezi güýçlendirýär [44]. IPA-nyň metabolik potensiala we ECAR-a täsir etmeýändigi glikolitik ýoluň has az ileri tutulýandygyny görkezýär. Şonuň ýaly-da, başga bir gözlegde 1 mM IPA-nyň kardiomiositlerde, adam gepatosit öýjük liniýasynda (Huh7) we adam göbek damarynyň endotelial öýjüklerinde (HUVEC) mitohondrial dem alyş zynjyrynyň işjeňligini modullaşdyryp bilýändigi görkezildi; Şeýle-de bolsa, IPA-nyň kardiomiositlerde glikolize täsiri tapylmady, bu bolsa IPA-nyň beýleki öýjük görnüşleriniň bioenergiýasyna täsir edip biljekdigini görkezýär [45]. Şonuň üçin, biz 1 mM IPA-nyň ýumşak himiki aýrylyjy hökmünde hereket edip biljekdigini çaklaýarys, sebäbi ol mtDNK-nyň mukdaryny üýtgetmezden fibrogen gen ekspresiýasyny, öýjük morfologiýasyny we mitohondrial bioenergiýasyny ep-esli azaldyp biler [46]. Mitohondrial aýrylyjylar medeniýet arkaly induksiýa edilen fibrozy we HSC aktiwleşmesini basyp bilýär [47] we aýrylýan beloklar (UCP) ýa-da adenin nukleotid translokaza (ANT) ýaly käbir beloklar tarapyndan düzgünleşdirilýän ýa-da induksiýa edilen mitohondrial ATP önümçiligini azaldyp bilýär. Öýjük görnüşine baglylykda, bu hadysa öýjükleri apoptozdan gorap we/ýa-da apoptozy höweslendirip bilýär [46]. Şeýle-de bolsa, IPA-nyň gematopoetik kök öýjükleriniň işjeňsizleşdirilmeginde mitohondrial aýrylyjy hökmünde roluny aýdyňlaşdyrmak üçin goşmaça barlaglar zerurdyr.
Soňra biz mitohondrial dem alyşdaky üýtgeşmeleriň diri LX-2 öýjüklerinde mitohondrial morfologiýada şöhlelenýändigini ýa-da ýokdugyny öwrendik. Gyzykly tarapy, TGF-β1 bejergisi mitohondrial paýy sferikiden aralyk görnüşine üýtgedýär, mitohondrial şahalanma azalýar we mitohondrial bölünmede esasy faktor bolan DRP1 ekspresiýasynyň ýokarlanýar [48]. Mundan başga-da, mitohondrial parçalanma umumy tor çylşyrymlylygy bilen baglanyşyklydyr we birleşmeden bölünmä geçiş gematopoetik kök öýjükleriniň (HSC) aktiwleşmesi üçin möhümdir, mitohondrial bölünmäniň basylyp saklanmagy bolsa HSC apoptozyna getirýär [49]. Şeýlelik bilen, netijelerimiz TGF-β1 bejergisiniň şahalanmanyň azalmagy bilen mitohondrial tor çylşyrymlylygynyň peselmegine sebäp bolup biljekdigini görkezýär, bu bolsa aktiwleşdirilen gematopoetik kök öýjükleri (HSC) bilen baglanyşykly mitohondrial bölünmede has köp duş gelýär. Mundan başga-da, maglumatlarymyz IPA-nyň mitohondrial paýy sferikiden aralyk görnüşine üýtgedip biljekdigini we şeýdip OPA1 we MFN2 ekspresiýasyny azaldyp biljekdigini görkezdi. Barlaglar OPA1-iň peselmeginiň mitohondrial membran potensialynyň peselmegine we öýjük apoptozyny başlatmagyna sebäp bolup biljekdigini görkezdi [50]. MFN2-niň mitohondrial birleşme we apoptoz arkaly amala aşyrýandygy mälimdir[51]. Alnan netijeler, TGF-β1 we/ýa-da IPA tarapyndan LX-2 öýjükleriniň induksiýasynyň mitohondrial görnüşi we ölçegini, şeýle hem aktiwasiýa ýagdaýyny we toruň çylşyrymlylygyny modulirleýändigine şaýatlyk edýär.
Netijelerimiz TGFβ-1 we IPA-nyň utgaşdyrylan bejergisiniň apoptozdan gaça durýan öýjüklerde fibroz, apoptoz we diri galmak bilen baglanyşykly genleriň mRNA ekspresiýasyny düzgünleşdirmek arkaly mtDNK-ny we öýjük morfologik parametrlerini azaldyp biljekdigini görkezýär. Hakykatdan-da, IPA AKT1-iň we COL1A2 we MMP2 ýaly möhüm fibroz genleriniň mRNA ekspresiýa derejesini peseltdi, ýöne apoptoz bilen baglanyşykly CASP8 ekspresiýa derejesini ýokarlandyrdy. Netijelerimiz IPA bejergisinden soň BAX ekspresiýasynyň peselendigini we TIMP1 maşgalasynyň kiçi birlikleriniň, BCL-2 we NF-κB-niň mRNA ekspresiýasynyň ýokarlanandygyny görkezdi, bu bolsa IPA-nyň apoptozdan gaça durýan gematopoetik kök öýjüklerinde (HSC) diri galmak signallaryny höweslendirip biljekdigini görkezýär. Bu molekulalar aktiwleşdirilen gematopoetik kök öýjüklerinde diri galmak üçin signal hökmünde hereket edip biler, bu bolsa anti-apoptotik beloklaryň (meselem, Bcl-2) ekspresiýasynyň ýokarlanmagy, pro-apoptotik BAX ekspresiýasynyň peselmegi we TIMP bilen NF-κB arasyndaky çylşyrymly özara täsir bilen baglanyşykly bolup biler [5, 7]. IPA öz täsirini PXR arkaly amala aşyrýar we biz TGF-β1 we IPA bilen utgaşdyrylan bejerginiň PXR mRNA ekspresiýa derejesini ýokarlandyrandygyny, bu bolsa HSC aktiwleşmesiniň basylyp ýatyrylmagyny görkezýändigini anykladyk. Aktiwleşdirilen PXR signallaşdyrmasynyň in vivo we in vitro HSC aktiwleşmesiniň basylyp ýatyrylýandygy mälim [52, 53]. Biziň netijelerimiz IPA-nyň apoptozy höweslendirmek, fibrozy we mitohondrial metabolizmi azaltmak we aktiwleşdirilen HSC fenotipini inaktiwleşdirilene öwürýän adaty prosesler bolan diri galmak signallaryny güýçlendirmek arkaly aktiwleşdirilen HSC-leriň arassalanmagyna gatnaşyp biljekdigini görkezýär. IPA-nyň apoptozdaky mümkin bolan mehanizminiň we rolunyň başga bir mümkin düşündirişi, onuň disfunksiýal mitohondriýalary esasan mitofagiýa (içki ýol) we daşarky TNF signallaşdyrma ýoly (1-nji tablisa) arkaly arassalamagydyr, bu bolsa NF-κB diri galmak signallaşdyrma ýoly bilen gönüden-göni baglanyşyklydyr (Goşmaça surat 7). Gyzykly tarapy, IPA bilen baglanyşykly baýlaşdyrylan genler apoptoz ýolunda pro-apoptotik we pro-diri galmak signallaryny döredip bilýär [54], bu bolsa IPA-nyň bu genler bilen özara täsirleşmek arkaly apoptotik ýoly ýa-da diri galmagy döredip biljekdigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, IPA-nyň HSC aktiwleşmesi wagtynda apoptozy ýa-da diri galmagy nädip döredýändigi we onuň mehanistik ýollary belli däl bolmagynda galýar.
IPA içege mikrobiotasy arkaly iýmit triptofanyndan emele gelýän mikrobial metabolitdir. Barlaglar onuň içege gurşawynda iltihaplanma garşy, antioksidant we epigenetiki düzgünleşdiriji häsiýetlere eýedigini görkezdi.[55] Barlaglar IPA-nyň içege päsgelçilik funksiýasyny üýtgedip we oksidatiw stressi azaldyp bilýändigini görkezdi, bu bolsa onuň ýerli fiziologiki täsirlerine goşant goşup biler.[56] Aslynda, IPA gan aýlanyşy arkaly nyşana organlara daşalýar we IPA triptofan, serotonin we indol töremeleri bilen meňzeş esasy metabolit gurluşyny paýlaşýandygy sebäpli, IPA metabolik täsirleri amala aşyrýar we bu bolsa bäsdeşlikli metabolik netijelere getirýär.[52] IPA fermentlerde ýa-da reseptorlarda baglanyş ýerleri üçin triptofandan alynýan metabolitler bilen bäsleşip, kadaly metabolik ýollary bozup biler. Bu bolsa, onuň terapewtiki penjiresini has gowy düşünmek üçin onuň farmakokinetikasy we farmakodinamikasy boýunça goşmaça barlaglaryň zerurdygyny görkezýär.[57] Munuň gematopoetik kök öýjüklerinde (HSC) hem bolup biljekdigi ýa-da bolup bilmejekdigi belli däl.
Biz gözlegimiziň käbir çäklendirmeleriniň bardygyny boýun alýarys. IPA bilen baglanyşykly gatnaşyklary aýratyn öwrenmek üçin, biz 2-nji tip diabetli (T2DM) näsaglary çykardyk. Munuň netijelerimiziň 2-nji tip diabetli we bagyr keseliniň ösen näsaglaryna giňden ulanylmagyny çäklendirýändigini boýun alýarys. Adam ganynda IPA-nyň fiziologiki konsentrasiýasy 1–10 μM bolsa-da [11, 20], 1 mM IPA konsentrasiýasy iň ýokary zäherli däl konsentrasiýa [15] we iň ýokary apoptoz tizligine esaslanyp saýlanyldy, nekrotik öýjük ilatynyň göteriminde tapawut ýok. Bu gözlegde IPA-nyň suprafiziologik derejeleri ulanylsa-da, häzirki wagtda IPA-nyň netijeli dozasy barada ylalaşyk ýok [52]. Netijelerimiz ähmiýetli bolsa-da, IPA-nyň giň metabolik ykbaly gözlegiň işjeň ugry bolmagynda galýar. Mundan başga-da, ganynda IPA derejeleri bilen bagyr transkriptleriniň DNK metilleşmesi arasyndaky baglanyşyk baradaky netijelerimiz diňe gematopoetik kök öýjüklerinden (HSC) däl, eýsem bagyr dokumalaryndan hem alyndy. Biz transkriptom analizinden öňki netijelerimize esaslanyp, IPA-nyň gematopoetik kök öýjükleriniň (HSC) aktiwleşmesi bilen baglanyşyklydygyny we HSC-leriň bagyr fibrozynyň ösüşine gatnaşýan esasy öýjüklerdigini [15] göz öňünde tutup, adam LX-2 öýjüklerini ulanmagy saýladyk. Bagyr köp öýjük görnüşinden ybarat, şonuň üçin IPA-nyň roluny we onuň beýleki bagyr öýjük görnüşleri bilen özara täsirini öwrenmek üçin gepatosit-HSC-immun öýjükleriniň bilelikdäki medeniýet ulgamy, kaspaza aktiwleşmesi we DNK parçalanmasy, şeýle hem belok derejesini öz içine alýan täsir mehanizmi ýaly beýleki öýjük modellerini göz öňünde tutmaly.