Makala “Kökeleriň kesel döredijilere we zyýankeşlere garşy durnuklylygyny ýokarlandyrmak” atly ylmy-barlag mowzugynyň bir bölegidir, ähli 5 makalany görüň.
Kömelek ösümlik keseliniň nekrozynyň sebäpkär agenti Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary dürli eýe ösümliklerini ýokuşdyrmak üçin köp gatly strategiýany ulanýar. Bu gözlegde, Pseudomonas sclerotiorum sebäpli ak küýze Phaseolus vulgaris L.-iň molekulýar, fiziologiki we biohimiki jogaplaryny güýçlendirmek üçin alternatiw dolandyryş strategiýasy hökmünde beýleki möhüm aminokislotalaryň sintezini höweslendirýän belok däl aminokislota diamin L-ornitiniň ulanylmagy teklip edilýär. In vitro tejribeler L-ornitiniň doza baglylykda S. pyrenoidosa-nyň miseliýa ösüşini ep-esli derejede basyp saklaýandygyny görkezdi. Mundan başga-da, ol parnik şertlerinde ak küýzüň agyrlygyny ep-esli azaldyp bilerdi. Mundan başga-da, L-ornitin bejerilen ösümlikleriň ösüşini höweslendirdi, bu bolsa synag edilen L-ornitiniň konsentrasiýalarynyň bejerilen ösümlikler üçin fitotoksik däldigini görkezýär. Mundan başga-da, L-ornitin fermentatiw däl antioksidantlaryň (umumy ereýän fenol we flavonoidler) we fermentatiw antioksidantlaryň (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) we polifenol oksidaza (PPO)) ekspresiýasyny güýçlendirdi we antioksidant bilen baglanyşykly üç geniň (PvCAT1, PvSOD we PvGR) ekspresiýasyny ýokarlandyrdy. Mundan başga-da, silika analizinde S. sclerotiorum genomynda çaklanylýan oksaloasetat asetilgidrolaza (SsOAH) belogynyň bardygyny ýüze çykardy, bu bolsa funksional analiz, saklanan domenler we topologiýa babatda Aspergillus fijiensis (AfOAH) we Penicillium sp. (PlOAH) oksaloasetat asetilgidrolaza (SsOAH) belogyna örän meňzeşdi. Gyzykly tarapy, L-ornitiniň kartoşka dekstroza şorbasyna (PDB) goşulmagy S. sclerotiorum miseliýasynda SsOAH geniniň ekspresiýasyny ep-esli peseltdi. Şonuň ýaly-da, L-ornitiniň ekzogen ulanylmagy bejerilen ösümliklerden ýygnalan kömelek miseliýalarynda SsOAH geniniň ekspresiýasyny ep-esli azaldy. Ahyrsoňy, L-ornitiniň ulanylmagy PDB gurşawynda we zeper ýeten ýapraklarda oksalat turşusynyň bölünip çykmagyny ep-esli azaldy. Netijede, L-ornitin zeper ýeten ösümlikleriň gorag reaksiýasyny güýçlendirmek bilen birlikde, oksidleniş-diklenme derejesini saklamakda möhüm rol oýnaýar. Bu gözlegiň netijeleri ak kömelekleriň öňüni almak we onuň noýba önümçiligine we beýleki ekinlere täsirini azaltmak üçin innowasion, ekologiýa taýdan arassa usullary işläp düzmäge kömek edip biler.
Nekrotrofik kömelek Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary tarapyndan döredilýän ak kömelek, global noýba (Phaseolus vulgaris L.) önümçiligine çynlakaý howp salýan weýran ediji, hasyly peseldýän keseldir (Bolton we beýlekiler, 2006). Sclerotinia sclerotiorum, 600-den gowrak ösümlik görnüşiniň giň meýdany we öý dokumalaryny spesifik däl usulda çaltlyk bilen ýok etmek ukyby bilen, toprakda ýaýraýan kömelek ösümlik patogenleriniň iň kyn gözegçilikde saklanýanlarynyň biridir (Liang we Rollins, 2018). Amatsyz şertlerde, ol öz ýaşaýyş sikliniň möhüm tapgyryny başdan geçirýär we toprakda "sklerotiýa" diýlip atlandyrylýan gara, gaty, tohum ýaly gurluşlar ýa-da ýokançly ösümlikleriň miseliýasynda ýa-da kök çukurynda ak, tüýli ösüşler hökmünde uzak wagtlap ýatyp galýar (Schwartz we beýlekiler, 2005). S. sclerotiorum sklerotiýalary emele getirip bilýär, bu bolsa onuň ýokançly meýdanlarda uzak wagtlap ýaşamagyna we kesel döwründe dowam etmegine mümkinçilik berýär (Schwartz we başg., 2005). Sklerotiýalar iýmit maddalaryna baýdyr, toprakda uzak wagtlap saklanyp bilýär we indiki ýokançlyklar üçin esasy inokulýasiýa bolup hyzmat edýär (Schwartz we başg., 2005). Amatly şertlerde sklerotiýalar ösüp çykýar we howa arkaly ýaýraýan sporalary öndürýär, olar ösümligiň ähli ýerüsti böleklerine, şol sanda güllere, sapaklara ýa-da kapsulalara ýokançlyk getirip bilýär (Schwartz we başg., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum öz eýe ösümliklerini ýokuşdyrmak üçin köp gatly strategiýany ulanýar, sklerotial ösüşden başlap, alamatlaryň ösmegine çenli birnäçe utgaşykly wakalary öz içine alýar. Ilki bilen, S. sclerotiorum apotesiýa diýlip atlandyrylýan kömelek ýaly gurluşlardan asma sporalary (askosporalar diýilýär) öndürýär, olar howada bolýar we ýokuşan ösümlik galyndylarynda hereketsiz sklerotiýa öwrülýär (Bolton we başg., 2006). Soňra kömelek ösümlik öýjük diwarynyň pH-ny gözegçilikde saklamak, fermentatiw dargamagy we dokumalaryň çozuşyny höweslendirmek (Hegedus we Rimmer, 2005) we eýe ösümligiň oksidatiw partlamasyny basyp ýatyrmak üçin wirulentlik faktory bolan oksalik turşusyny bölüp çykarýar. Bu kislotalaşma prosesi ösümlik öýjük diwaryny gowşadýar, kömelek öýjük diwaryny dargadýan fermentleriň (CWDE) kadaly we netijeli işlemegi üçin amatly gurşawy döredýär, bu bolsa kesel döredijiniň fiziki päsgelçilikden geçip, eýe dokumalaryna aralaşmagyna mümkinçilik berýär (Marciano we başg., 1983). S. sclerotiorum içine girenden soň, poligalakturonaza we sellýulaza ýaly birnäçe CWDE-leri bölüp çykarýar, bu bolsa onuň ýokançly dokumalarda ýaýramagyna ýardam edýär we dokumalaryň nekrozyna sebäp bolýar. Ýaralaryň we gifal örtükleriniň ösmegi ak küýzäniň häsiýetli alamatlaryna getirýär (Hegedus we Rimmer, 2005). Şol bir wagtyň özünde, eýe ösümlikler patogen bilen baglanyşykly molekulýar nusgalary (PAMP) nusga tanamak reseptorlary (PRR) arkaly tanaýarlar we netijede goranyş jogaplaryny işjeňleşdirýän birnäçe signal wakalaryny döredýärler.
Keselleriň öňüni almak boýunça onlarça ýyllap tagalla edilendigine garamazdan, beýleki täjirçilik ekinlerinde bolşy ýaly, noýbada hem patogeniň garşylygy, ýaşamagy we uýgunlaşmagy sebäpli ýeterlik derejede çydamly germ plazmasynyň ýetmezçiligi dowam edýär. Şonuň üçin keselleri dolandyrmak örän kyn we medeni tejribeleriň, biologik gözegçiligiň we himiki fungisidleriň utgaşmasyny öz içine alýan toplumlaýyn, köpugurly strategiýany talap edýär (O'Sullivan we beýlekiler, 2021). Ak küýzüň himiki gözegçiligi iň netijelidir, sebäbi fungisidler dogry we dogry wagtda ulanylanda keseliň ýaýramagyny netijeli gözegçilikde saklap, infeksiýanyň agyrlygyny azaldyp we hasyl ýitgisini azaldyp biler. Şeýle-de bolsa, fungisidleriň aşa köp ulanylmagy we olara aşa köp bil baglamak S. sclerotiorum-yň çydamly ştammlarynyň döremegine sebäp bolup, maksatly däl organizmlere, topragyň saglygyna we suwuň hiline ýaramaz täsir edip biler (Le Cointe we beýlekiler, 2016; Ceresini we beýlekiler, 2024). Şonuň üçin ekologiýa taýdan arassa alternatiwalary tapmak iň esasy ileri tutulýan ugur boldy.
Putresin, spermidine, spermin we kadawerin ýaly poliaminler (PA) toprak arkaly ýaýraýan ösümlik kesel döredijilerine garşy geljegi uly alternatiwa hökmünde hyzmat edip biler we şeýdip howply himiki fungisidleriň ulanylyşyny doly ýa-da bölekleýin azaldýar (Nehela we beýlekiler, 2024; Yi we beýlekiler, 2024). Ýokary ösümliklerde PA köp sanly fiziologiki proseslere gatnaşýar, şol sanda öýjükleriň bölünmegine, tapawutlanmagyna we abiotik we biotiki stresslere jogap bermäge gatnaşýar (Killiny we Nehela, 2020). Olar antioksidantlar hökmünde hereket edip, reaktiw kislorod görnüşlerini (ROS) arassalamaga kömek edip, redoks gomeostazyny saklap bilýärler (Nehela we Killiny, 2023), goranyş bilen baglanyşykly genleri döredip bilýärler (Romero we başg., 2018), dürli metabolik ýollary düzgünleşdirip bilýärler (Nehela we Killiny, 2023), endogen fitohormonlary modullaşdyryp bilýärler (Nehela we Killiny, 2019), ulgamlaýyn gazanylan garşylygy (SAR) döredip bilýärler we ösümlik-patogen özara täsirlerini düzgünleşdirip bilýärler (Nehela we Killiny, 2020; Asija we başg., 2022; Czerwoniec, 2022). Ösümlikleriň goranyşyndaky PA-laryň aýratyn mehanizmleriniň we rollarynyň ösümlik görnüşlerine, patogenlere we daşky gurşaw şertlerine baglylykda üýtgeýändigini bellemek gerek. Ösümliklerde iň köp duş gelýän PA esasy poliamin L-ornitinden biosintezlenýär (Killiny we Nehela, 2020).
L-ornitin ösümlikleriň ösüşi we ösmeginde köp sanly rol oýnaýar. Mysal üçin, öňki barlaglar tüwide (Oryza sativa) ornitiniň azotyň gaýtadan işlenilmegi (Liu we beýlekiler, 2018), tüwi hasyly, hili we hoşboý yslylygy (Lu we beýlekiler, 2020) we suw stresine reaksiýa (Yang we beýlekiler, 2000) bilen baglanyşykly bolup biljekdigini görkezdi. Mundan başga-da, L-ornitiniň ekzogen ulanylmagy gant çugundurynda (Beta vulgaris) gurakçylyga çydamlylygy ep-esli ýokarlandyrdy (Hussein we beýlekiler, 2019) we sogan (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu we Çavuşoǧlu, 2021) we keşýu (Anacardium occidentale) ösümliklerinde duz stresini ýeňilleşdirdi (da Rocha we beýlekiler, 2012). L-ornitiniň abiotik stresden goranmakdaky mümkin bolan roly, onuň bejerilen ösümliklerde prolin toplanmagyna gatnaşmagy bilen baglanyşykly bolup biler. Mysal üçin, prolin metabolizmi bilen baglanyşykly genleriň, meselem, ornitin delta aminotransferaza (delta-OAT) we prolin dehidrogenaza (ProDH1 we ProDH2) genleriniň, öň Nicotiana benthamiana we Arabidopsis thaliana-nyň eýe bolmadyk Pseudomonas syringae ştammlaryndan goranmagyna gatnaşýandygy habar berildi (Senthil-Kumar we Mysore, 2012). Beýleki tarapdan, patogenleriň ösüşi üçin kömelek ornitin dekarboksilazasy (ODC) zerurdyr (Singh we başg., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-niň ODC-sini eýe tarapyndan döredilen genleriň susdurylmagy (HIGS) arkaly nyşana almak pomidor ösümlikleriniň Fusarium solmagyna garşy durnuklylygyny ep-esli ýokarlandyrdy (Singh we başg., 2020). Şeýle-de bolsa, ekzogen ornitiniň fitopatogenler ýaly biotik stresslere garşy ulanylmagynyň mümkin bolan roly gowy öwrenilmedi. Has möhümi, ornitiniň kesellere garşy duruşlylygyna we onuň bilen baglanyşykly biohimiki we fiziologiki hadysalara täsiri köp derejede öwrenilmedik bolmagynda galýar.
S. sclerotiorum bilen baklagilleriň ýokuşmagynyň çylşyrymlylygyny düşünmek netijeli gözegçilik strategiýalaryny işläp düzmek üçin möhümdir. Bu gözlegde biz diamin L-ornitiniň gorag mehanizmlerini we baklagil ösümlikleriniň Sclerotinia sclerotiorum ýokuşmagyna garşy durnuklylygyny güýçlendirmekde esasy faktor hökmünde mümkin bolan roluny anyklamagy maksat edindik. Biz ýokuşan ösümlikleriň gorag jogaplaryny güýçlendirmekden başga-da, L-ornitiniň oksidleniş-diklenme derejesini saklamakda hem möhüm rol oýnaýandygyny çaklaýarys. Biz L-ornitiniň mümkin bolan täsirleriniň fermentatiw we fermentatiw däl antioksidant gorag mehanizmleriniň düzgünleşdirilmegi we mantar patogenligi/wirulentlik faktorlary we degişli beloklar bilen baglanyşykly päsgelçilik bilen baglanyşyklydygyny teklip edýäris. L-ornitiniň bu iki funksiýasy ony ak küýzäniň täsirini azaltmak we umumy baklagil ekinleriniň bu güýçli mantar patogenine garşy durnuklylygyny ýokarlandyrmak üçin durnukly strategiýa üçin geljegi uly dalaşgär edýär. Şu gözlegiň netijeleri ak küýzä garşy göreşmek we onuň baklagil önümçiligine täsirini azaltmak üçin innowasion, ekologiýa taýdan arassa usullary işläp düzmäge kömek edip biler.
Bu gözlegde, synag materialy hökmünde adaty noýbanyň duýgur täjirçilik görnüşi bolan Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) ulanyldy. Sagdyn tohumlar Müsüriň Oba hojalyk gözleg merkeziniň (ARC) Meýdan ekinlerini öwrenmek institutynyň (FCRI) Döwür ösümliklerini öwrenmek bölümi tarapyndan berildi. Bäş tohum ýyladyşhana şertlerinde (25 ± 2 °C, otnositel çyglylyk 75 ± 1%, 8 sagat ýagtylyk / 16 sagat garaňky) S. sclerotiorum bilen ýokançlanan toprak bilen doldurylan plastik gaplara (içki diametri 35 sm, çuňlugy 50 sm) ekildi. Ekilenden 7–10 gün soň (DPS), her gapda diňe birmeňzeş ösýän iki sany nahal we üç sany doly açylan ýaprak galdyrmak üçin nahallar inçeldildi. Ähli küýze ösümlikleri iki hepdede bir gezek suwaryldy we berlen görnüş üçin maslahat berilýän möçberde aýda bir gezek dökün berildi.
500 mg/L konsentrasiýaly L-ornitindiamin (şeýle hem (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik kislotasy; Sigma-Aldrich, Darmştadt, Germaniýa diýlip hem atlandyrylýar) taýýarlamak üçin ilki 50 mg 100 ml steril distillenen suwda eredildi. Soňra esasy ergin suwlandyryldy we soňraky tejribelerde ulanyldy. Gysgaça aýdylanda, L-ornitin konsentrasiýalarynyň alty tapgyry (12,5, 25, 50, 75, 100 we 125 mg/L) in vitro synagdan geçirildi. Mundan başga-da, steril distillenen suw negatiw gözegçilik (Mock) hökmünde ulanyldy we oňyn gözegçilik hökmünde “Rizolex-T” 50% çygly poroşokly täjirçilik fungisidi (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Garbiýa gubernatorlygy, Müsür) ulanyldy. Söwda fungisidi “Rizolex-T” bäş konsentrasiýada (2, 4, 6, 8 we 10 mg/L) in vitro synagdan geçirildi.
Ak küýzäniň tipik alamatlaryny görkezýän (ýokuşma derejesi: 10–30%) adaty noýba sapaklarynyň we kapsulalarynyň nusgalary täjirçilik hojalyklaryndan ýygnaldy. Ýokançly ösümlik materiallarynyň köpüsi görnüş/dürlilik boýunça kesgitlense-de (duýgur täjirçilik görnüşi Giza 3), beýlekileri, esasanam ýerli bazarlardan alnanlary, näbelli görnüşlerdendi. Ýygnalan ýokançly materiallar ilki 0,5% natriý gipoxlorit ergini bilen 3 minutlap ýüzleý dezinfeksiýa edildi, soňra steril distilled suw bilen birnäçe gezek çaýkalyp, artykmaç suwy aýyrmak üçin steril süzgüç kagyzy bilen guradyldy. Soňra ýokançly organlar ortaky dokumadan (sagdyn we ýokançly dokumalaryň arasyndan) kiçi böleklere bölünip, kartoşka dekstroza agarynda (PDA) ösdürilip ýetişdirildi we sklerotiýanyň emele gelmegini höweslendirmek üçin 25 ± 2 °C-de 12 sagat ýagtylyk/12 sagat garaňky sikl bilen 5 günläp inkubasiýa edildi. Miseliýa uç usuly hem garyşyk ýa-da hapalanan medeniýetlerden kömelek izolýatlaryny arassalamak üçin ulanyldy. Arassalanan kömelek izolýaty ilki onuň medeni morfologiki aýratynlyklaryna esaslanyp kesgitlendi we soňra mikroskopiki aýratynlyklaryna esaslanyp S. sclerotiorumdygy tassyklanyldy. Ahyrsoňy, ähli arassalanan izolýatlar Kohyň postulatlaryna laýyk gelmek üçin duýgur umumy noýba sortunyň Giza 3-de patogenlik üçin synagdan geçirildi.
Mundan başga-da, iň inwaziw S. sclerotiorum izolýaty (3-nji izolýat) White we beýlekiler, 1990; Baturo-Ciesniewska we beýlekiler, 2017 tarapyndan beýan edilişi ýaly içki transkripsiýa edilen aralyk (ITS) yzygiderliligine esaslanyp has-da tassyklanyldy. Gysgaça aýdylanda, izolýatlar kartoşka dekstroza şorbasynda (PDB) ösdürilip, 25 ± 2 °C-de 5-7 günläp inkubasiýa edildi. Soňra kömelek miseli ýygnaldy, peýnirden süzüldi, iki gezek steril suw bilen ýuwuldy we steril süzgüç kagyzy bilen guradyldy. Genom DNK-sy Quick-DNA™ kömelek/bakteriýa miniprep toplumy (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah we beýlekiler, 2022, 2024) ulanylyp bölünip alyndy. Soňra ITS rDNK sebiti ITS1/ITS4 belli bir praýmer jübütini (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; garaşylýan ululyk: 540 bp) ulanyp güýçlendirildi (Baturo-Ciesniewska we beýlekiler, 2017). Arassalanan PZR önümleri yzygiderlilik üçin iberildi (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNK yzygiderlilikleri Sanger yzygiderlilik usuly arkaly iki taraplaýyn yzygiderlilik edildi. Soňra ýygnalan sorag yzygiderlilikleri BLASTn programma üpjünçiligini ulanyp GenBank-daky we Milli Biotehnologiýa Maglumat Merkezindäki (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) iň soňky maglumatlar bilen deňeşdirildi. Sorag yzygiderliligi NCBI GenBank-daky iň soňky maglumatlardan (Goşmaça S1 tablisa) alnan 20 sany beýleki S. sclerotiorum ştammlary/izolýatlary bilen Molekulýar Ewolusiýa Genetika Analiz Paketindäki (MEGA-11; 11-nji wersiýa) ClustalW ulanylyp deňeşdirildi (Kumar we başg., 2024). Ewolusiýa analizi iň ýokary ähtimallyk usuly we umumy wagt boýunça gaýtaryp bolýan nukleotid çalyşma modeli ulanylyp geçirildi (Nei we Kumar, 2000). Iň ýokary logiki ähtimallygy bolan agaç görkezilýär. Ewristik gözleg üçin başlangyç agaç goňşy birleşýän (NJ) agaç (Kumar we başg., 2024) we iň ýokary parsimoniýa (MP) agajynyň arasynda has ýokary logiki ähtimallygy bolan agajy saýlamak arkaly saýlanýar. NJ agajy umumy wagt boýunça gaýtaryp bolýan model (Nei we Kumar, 2000) ulanylyp hasaplanan jübüt aralyk matrisasyny ulanyp guruldy.
L-ornitiniň we “Rizolex-T” bakterisidiniň antibakterial işjeňligi in vitro şertlerinde agar diffuziýa usuly bilen kesgitlenildi. Usul: L-ornitiniň esasy ergininiň degişli mukdaryny (500 mg/L) alyp, degişlilikde 12,5, 25, 50, 75, 100 we 125 mg/L konsentrasiýaly erginleri taýýarlamak üçin ony 10 ml PDA iýmitlendiriji gurşaw bilen gowy garyşdyryň. Gözegçilik hökmünde “Rizolex-T” fungisidiniň bäş konsentrasiýasy (2, 4, 6, 8 we 10 mg/L) we steril distillenen suw ulanyldy. Gurşaw gatyşandan soň, diametri 4 mm bolan täze taýýarlanan Sclerotinia sclerotiorum medeniýetiniň miselial tıkajy Petri gapjygynyň merkezine geçirildi we miselium tutuş gözegçilik Petri gapjygyny örtýänçä 25±2°C temperaturada ösdürilip ýetişdirildi, şondan soň kömelekleriň ösüşi hasaba alyndy. 1-nji deňleme arkaly S. sclerotiorum-yň radial ösüşiniň pese gaçmagynyň prosentini hasaplaň:
Synag iki gezek gaýtalandy, her bir gözegçilik/eksperimental topar üçin alty biologik gaýtalama we her bir biologik gaýtalama üçin bäş küýze (her küýzede iki ösümlik) ulanyldy. Synag netijeleriniň takyklygyny, ygtybarlylygyny we gaýtalanmagyny üpjün etmek üçin her bir biologik gaýtalama iki gezek seljerildi (iki tehniki gaýtalama). Mundan başga-da, probit regressiýa analizi ýarym-maksimal inhibitiw konsentrasiýany (IC50) we IC99-y hasaplamak üçin ulanyldy (Prentice, 1976).
L-ornitiniň parnik şertlerinde mümkinçiliklerini bahalandyrmak üçin iki gezek yzly-yzyna küýzelerde synag geçirildi. Gysgaça aýdylanda, küýzeler sterilizirlenen toýun-çäge topragy bilen dolduryldy (3:1) we täze taýýarlanan S. sclerotiorum medeniýeti bilen sanjym edildi. Ilki bilen, S. sclerotiorum-yň iň inwaziw izolýaty (3-nji izolýat) bir sklerotiýi iki bölege bölmek, ony ýüzüni aşak edip PDA-nyň üstüne goýmak we mitseliýanyň ösüşini höweslendirmek üçin 25°C-de 4 günläp yzygiderli garaňkylykda (24 sagat) inkubasiýa etmek arkaly ösdürilip ýetişdirildi. Soňra öňdebaryjy gyradan dört sany 5 mm diametrli agar tıkaçlary alyndy we 100 g bugdaý we tüwi kepeginiň steril garyndysy (1:1, v/v) bilen sanjym edildi we ähli kolbalar sklerotiýanyň emele gelmegini höweslendirmek üçin 25 ± 2°C-de 5 günläp 12 sagat ýagtylyk/12 sagat garaňkylyk siklinde inkubasiýa edildi. Toprak goşmazdan öň, ähli kolbalaryň mazmuny birmeňzeşligi üpjün etmek üçin gowy garyşdyryldy. Soňra her bir gapda patogenleriň yzygiderli konsentrasiýasyny üpjün etmek üçin 100 g kolonizasiýa kepegi garyndysy goşuldy. Mantarlaryň ösüşini işjeňleşdirmek üçin sanjym edilen gaplar suwaryldy we 7 günläp ýyladyşhana şertlerinde goýuldy.
Soňra her bir küýzede Giza 3 görnüşiniň bäş tohumy ekildi. L-ornitin we Rizolex-T fungisidi bilen işlenen küýzeler üçin sterilizirlenen tohumlar ilki iki birleşmäniň suw ergininde iki sagatlap, degişlilikde takmynan 250 mg/L we 50 mg/L soňky IC99 konsentrasiýasy bolan suwda çümdürildi we soňra ekmezden öň bir sagat howada guradyldy. Beýleki tarapdan, tohumlar negatiw gözegçilik hökmünde steril distilizirlenen suwda çümdürildi. 10 günden soň, ilkinji suwaryşdan öň, nahallar inçeldildi we her küýzede diňe iki arassa nahal galdy. Mundan başga-da, S. sclerotiorum bilen ýokuşmagy üpjün etmek üçin, şol bir ösüş tapgyryndaky (10 gün) noýba ösümliginiň sapaklary sterilizirlenen skalpel arkaly iki dürli ýerde kesildi we her ýara takmynan 0,5 g kolonizasiýa kepek garyndysy goýuldy, soňra ähli ýokuşdyrylan ösümliklerde ýokuşmany we keseliň ösmegini höweslendirmek üçin ýokary çyglylyk ulanyldy. Gözegçilik ösümlikleri hem şeýle ýaralandy we ýaranyň içine deň mukdarda (0,5 g) steril, kolonizasiýa edilmedik kepek garyndysy goýuldy we keseliň ösüşi üçin daşky gurşawy simulýasiýa etmek we bejeriş toparlarynyň arasynda yzygiderliligi üpjün etmek maksady bilen ýokary çyglylykda saklandy.
Bejeriş usuly: Lobýa nahallary topragy suwarmak arkaly 500 ml L-ornitiniň suw ergini (250 mg/l) ýa-da Rizolex-T fungisidi (50 mg/l) bilen suwaryldy, soňra bejergi 10 gün aralyk bilen üç gezek gaýtalandy. Plasebo bilen bejerilen gözegçilik görnüşleri 500 ml steril distillenen suw bilen suwaryldy. Ähli bejergiler ýyladyşhana şertlerinde (25 ± 2°C, 75 ± 1% otnositel çyglylyk we 8 sagat ýagtylyk/16 sagat garaňky fotoperiody) geçirildi. Ähli küýzeler iki hepdede bir gezek suwaryldy we aýda belli bir görnüş üçin tekliplere we öndürijiň görkezmelerine laýyklykda ýapraklara çilemek arkaly 3-4 g/l konsentrasiýada deňagramly NPK döküni (20-20-20, 3,6% kükürt we TE mikroelementleri bilen; Zain Seeds, Müsür) bilen bejerildi. Başgaça görkezilmedik bolsa, doly giňelen ýetişen ýapraklar (ýokardan 2-nji we 3-nji ýapraklar) her bir biologik replikasiýadan bejergiden 72 sagat soň (hpt) ýygnaldy, gomogenleşdirildi, jemlendi we oksidatiw stress görkezijileriniň in situ gistohimiki lokalizasiýasyny, lipid peroksidasiýasyny, fermentatiw we fermentatiw däl antioksidantlary we gen ekspresiýasyny öz içine alýan, ýöne diňe şular bilen çäklenmän, goşmaça seljermeler üçin -80 °C-de saklandy.
Ak kömelek infeksiýasynyň intensiwligi, Teran we beýlekiler (2006) tarapyndan üýtgedilen Petzoldt we Dikson şkalasyna (1996) esaslanyp, inokuasiýadan 21 gün soň hepdede 1–9 şkalasyny (Goşmaça S2 tablisa) ulanyp bahalandyryldy. Gysgaça aýdylanda, noýba ösümlikleriniň göwdeleri we şahalary inokuasiýa nokadyndan başlap, düwünleriň arasyndaky we düwünleri boýunça zeperlenmeleriň ösüşini yzarlamak üçin barlandy. Soňra zeperlenme nokadyndan göwde ýa-da şaha boýunça iň uzak nokada çenli aralyk ölçenildi we zeperlenme nokadynyň ýerleşýän ýerine esaslanyp 1–9 bal berildi, bu ýerde (1) inokuasiýa nokadynyň golaýynda görünýän infeksiýanyň ýokdugyny we (2–9) zeperlenme ululygynyň we düwünleriň/düwünleriň arasyndaky ösüşiň kem-kemden artýandygyny görkezdi (Goşmaça S2 tablisa). Soňra ak kömelek infeksiýasynyň intensiwligi 2-nji formulany ulanyp göterime öwrüldi:
Mundan başga-da, keseliň ösüş egrisiniň aşagyndaky meýdan (AUDPC) ýakynda 3-nji deňleme arkaly adaty noýbanyň ak çüýremesi üçin uýgunlaşdyrylan formula (Shaner we Finney, 1977) arkaly hasaplandy:
Bu ýerde Yi = ti wagtyndaky keseliň agyrlygy, Yi+1 = indiki wagtdaky keseliň agyrlygy ti+1, ti = ilkinji ölçeg wagty (günlerde), ti+1 = indiki ölçeg wagty (günlerde), n = wagt nokatlarynyň ýa-da gözegçilik nokatlarynyň umumy sany. Ösümligiň beýikligi (sm), her ösümlikdäki şahalaryň sany we her ösümlikdäki ýapraklaryň sany ýaly lobya ösümliginiň ösüş parametrleri ähli biologik gaýtalanmalarda 21 günläp hepdede hasaba alyndy.
Her bir biologiki gaýtalamada ýaprak nusgalary (ýokardan ikinji we üçünji doly ösen ýapraklar) bejergiden soň 45-nji günde (soňky bejergiden 15 gün soň) ýygnaldy. Her bir biologik gaýtalama bäş küýzeden (her küýzede iki ösümlik) ybaratdy. Ezilen dokumanyň takmynan 500 mg-y garaňkyda 4 °C-de 80% aseton ulanyp, fotosintez pigmentlerini (hlorofil a, hlorofil b we karotenoidler) çykarmak üçin ulanyldy. 24 sagatdan soň nusgalar santrifuga edildi we üstki gatlak hlorofil a, hlorofil b we karotenoidleriň mazmunyny UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) ulanyp, üç dürli tolkun uzynlyklarynda (A470, A646 we A663 nm) siňdirilişini ölçemek arkaly kolorimetrik usulda kesgitlemek üçin ýygnaldy. Ahyrsoňy, fotosintez pigmentleriniň mazmuny Lichtenthaler (1987) tarapyndan beýan edilen aşakdaky 4–6 formulalar arkaly hasaplandy.
Bejerişden 72 sagat soň (hpt), her bir biologik replikasiýadan wodorod peroksidiň (H2O2) we superoksid anionynyň (O2•−) ýerinde gistohimiki ýerleşişi üçin ýapraklar (ýokardan ikinji we üçünji doly ösen ýapraklar) ýygnaldy. Her bir biologik replikasiýa bäş küýzeden ybaratdy (her küýzede iki ösümlik). Usulyň takyklygyny, ygtybarlylygyny we gaýtalanmagyny üpjün etmek üçin her bir biologik replika iki gezek seljerildi (iki tehniki replika). H2O2 we O2•− degişlilikde 0,1% 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germaniýa) ýa-da nitroglazol tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germaniýa) ulanylyp, Romero-Puertas we beýlekiler (2004) we Adam we beýlekiler (1989) tarapyndan kiçi üýtgetmeler bilen beýan edilen usullara eýerilip kesgitlenildi. H2O2-niň ýerinde gistohimiki ýerleşmegi üçin, bukletler 10 mM Tris buferinde (pH 7.8) 0.1% DAB bilen wakuum arkaly infiltrasiýa edildi we soňra otag temperaturasynda ýagtylykda 60 minutlap inkubasiýa edildi. Bukletler 4:1 (v/v) etanol:hloroformda (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Müsür) 0.15% (v/v) TCA-da agardyldy we soňra garaňkylaşýança ýagtylyga goýuldy. Şonuň ýaly-da, klapanlar O2•−-niň ýerinde gistohimiki ýerleşmegi üçin 0.1 w/v % HBT saklaýan 10 mM kaliý fosfat buferi (pH 7.8) bilen wakuum arkaly infiltrasiýa edildi. Bukletler otag temperaturasynda ýagtylykda 20 minut inkubasiýa edildi, soňra ýokardaky ýaly agardyldy we soňra gara gök/benewşe tegmiller peýda bolýança ýagtylandyryldy. Netijede goňur (H2O2 görkezijisi hökmünde) ýa-da gök-benewşe (O2•− görkezijisi hökmünde) reňkiniň intensiwligi ImageJ surat işleme paketiniň Fiji wersiýasyny ulanyp bahalandyryldy (http://fiji.sc; 2024-nji ýylyň 7-nji martynda girildi).
Malondialdegid (MDA; lipid peroksidleşmesiniň alamaty hökmünde) Du we Bramlage (1992) usulyna laýyklykda kiçi üýtgetmeler bilen kesgitlenildi. Her bir biologiki replikasiýadan (ýokarky tarapdan ikinji we üçünji doly ösen ýapraklar) ýapraklar bejerişden 72 sagat soň (hpt) ýygnaldy. Her bir biologiki replikasiýa bäş küýzeden (her küýzede iki ösümlik) ybaratdy. Her bir biologiki replikasiýa usulyň takyklygyny, ygtybarlylygyny we gaýtalanmagyny üpjün etmek üçin iki gezek seljerildi (iki tehniki replika). Gysgaça aýdylanda, MDA ekstraksiýasy üçin 0,5 g ýerlenen ýaprak dokumasy 0,01% butillenen gidroksitoluol (BHT; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) saklaýan 20% trihlorsirke turşusy (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABŞ) bilen ulanyldy. Soňra üstki gatlakdaky MDA mukdary UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) ulanyp 532 we 600 nm-de absorbsiýany ölçemek arkaly kolorimetrik usulda kesgitlenildi we soňra nmol g−1 FW hökmünde görkezildi.
Fermentatiw däl we fermentatiw antioksidantlaryň bahalandyrylmagy üçin, her bir biologik replikadan 72 sagatdan soň (hpt) ýapraklar (ýokardan ikinji we üçünji doly ösen ýapraklar) ýygnaldy. Her bir biologik replika bäş küýzeden ybaratdy (her küýzede iki ösümlik). Her bir biologik nusga iki gezek seljerildi (iki tehniki nusga). Iki ýaprak suwuk azot bilen üweldi we fermentatiw we fermentatiw däl antioksidantlaryň, umumy aminokislotalaryň, prolin mukdarynyň, gen ekspresiýasynyň we oksalat mukdarynyň kesgitlenmegi üçin gönüden-göni ulanyldy.
Jemi ereýän fenollaryň mukdary Kahkonen we beýlekiler (1999) tarapyndan beýan edilen usulyň kiçijik üýtgeşmeleri bilen Folin-Ciocalteu reagentini (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) ulanyp kesgitlenildi. Gysgaça aýdylanda, takmynan 0,1 g gomogenleşdirilen ýaprak dokumasy 20 ml 80% metanol bilen garaňkyda 24 sagatlap ekstraksiýa edildi we üstki gatlak santrifugadan soň ýygnaldy. Nusga ekstraktynyň 0,1 ml-i 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagentini (10%) garyşdyryldy, 30 sekuntlap ​​çaýkalyp, garaňkyda 5 minut goýuldy. Soňra her bir turba 0,5 ml 20% natriý karbonat erginini (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kair, Müsür) goşup, gowy garyşdyryp, otagyň temperaturasynda garaňkyda 1 sagatlap inkubasiýa edildi. Inkubasiýadan soň, reaksiýa garyndysynyň siňdirilişi 765 nm-de UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) arkaly ölçeldi. Nusga ekstraktlaryndaky umumy ereýän fenollaryň konsentrasiýasy gallik kislotasynyň kalibrleme egrisini (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) ulanyp kesgitlenildi we täze agramyň her gramy üçin gallik kislotasynyň milligram ekwiwalenti hökmünde görkezildi (mg GAE g-1 täze agram).
Jeridane we beýlekileriň (2006) usulyna laýyklykda, kiçi üýtgetmeler bilen kesgitlenildi. Gysgaça aýdylanda, ýokardaky metanol ekstraktynyň 0,3 ml-i 0,3 ml 5% alýumin hlorid ergini (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) bilen garyşdyryldy, güýçli garyşdyryldy we soňra otag temperaturasynda 5 minutlap inkubasiýa edildi, soňra 0,3 ml 10% kaliý asetat ergini (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Müsür) goşuldy, gowy garyşdyryldy we otag temperaturasynda 30 minutlap garaňkyda inkubasiýa edildi. Inkubasiýadan soň, reaksiýa garyndysynyň siňdirilişi UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) arkaly 430 nm-de ölçeldi. Nusga ekstraktlaryndaky umumy ereýän flawonoidleriň konsentrasiýasy rutin kalibrleme egrisi (TCI America, Portland, OR, ABŞ) arkaly kesgitlenildi we soňra täze agramyň her gramy üçin milligram rutin ekwiwalenti hökmünde görkezildi (mg RE g-1 täze agram).
Nohut ýapraklarynyň umumy erkin aminokislota mukdary Ýokoýama we Hiramatsu (2003) tarapyndan teklip edilen we Sun we beýlekiler (2006) tarapyndan üýtgedilen usula esaslanyp, üýtgedilen ningidrin reagentini (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) ulanyp kesgitlenildi. Gysgaça aýdylanda, 0,1 g ýerüsti dokuma pH 5,4 bufer bilen ekstraksiýa edildi we 200 μL üstki gatlak 200 μL ningidrin (2%) we 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, Nýu-Brunswik, Nýu-Jersi, ABŞ) bilen reaksiýa girizildi, gaýnag suw wannasynda 30 minutlap inkubasiýa edildi, soňra sowadyldy we UV-160A spektrofotometrini (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) ulanyp 580 nm-de ölçeldi. Beýleki tarapdan, prolin Bates usuly bilen kesgitlenildi (Bates we beýlekiler, 1973). Prolin 3% sulfosalisil turşusy (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) bilen ekstraksiýa edildi we santrifugadan soň, 0,5 ml üstki gatlak 1 ml buz sirke turşusy (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) we ningidrin reagent bilen garyşdyryldy, 90°C-da 45 minutlap inkubasiýa edildi, sowadyldy we ýokardaky ýaly spektrofotometr arkaly 520 nm-de ölçeldi. Ýaprak ekstraktlaryndaky umumy erkin aminokislotalar we prolin degişlilikde glisin we prolin kalibrleme egrilerini (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) ulanyp kesgitlenildi we mg/g täze agram hökmünde görkezildi.
Antioksidant fermentleriň fermentatiw işjeňligini kesgitlemek üçin, takmynan 500 mg gomogenleşdirilen dokuma 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) we 7,5% poliwinilpirrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) saklaýan 3 ml 50 mM Tris buferi (pH 7,8) bilen ekstraksiýa edildi, sowadyjyda (4 °C) 20 minutlap 10,000 × g-da sentrifuga edildi we üstki gatlak (çig ferment ekstrakty) ýygnaldy (El-Nagar we beýlekiler, 2023; Osman we beýlekiler, 2023). Soňra katalaza (CAT) Aebi (1984) usulyna laýyklykda, kiçi üýtgetmeler bilen (El-Nagar we beýlekiler, 2023; Osman we beýlekiler, 2023) fermentatiw işjeňligini kesgitlemek üçin 2 ml 0,1 M natriý fosfat buferi (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) we 100 μl 269 mM H2O2 ergini bilen reaksiýa geçirildi. Guaiakol-garaşly peroksidaza (POX) fermentatiw işjeňligi Harrach we beýlekileriň (2009) usuly arkaly kesgitlenildi. (2008) kiçi üýtgetmeler bilen (El-Nagar we beýlekiler, 2023; Osman we beýlekiler, 2023) we polifenol oksidazanyň (PPO) fermentatiw işjeňligi 2,2 ml 100 mM natriý fosfat buferi (pH 6.0), 100 μl guaýakol (TCI himiki maddalary, Portland, OR, ABŞ) we 100 μl 12 mM H2O2 bilen reaksiýadan soň kesgitlenildi. Usul (El-Nagar we beýlekiler, 2023; Osman we beýlekiler, 2023) usulyndan biraz üýtgedildi. Synag 0,1 M fosfat buferinde (pH 6.0) täze taýýarlanan 3 ml katehol ergini (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) (0,01 M) bilen reaksiýadan soň geçirildi. CAT işjeňligi 240 nm-de (A240) H2O2-niň parçalanyşyny gözegçilik etmek arkaly ölçeldi, POX işjeňligi 436 nm-de (A436) siňdirişiň artmagyny gözegçilik etmek arkaly ölçeldi we PPO işjeňligi UV-160A spektrofotometri (Şimadzu, Ýaponiýa) ulanyp, her 30 sekuntda 495 nm-de (A495) siňdirişiň üýtgemelerini ýazga almak arkaly ölçeldi.
Soňky bejergiden 72 sagat soň, noýba ýapraklarynda (ýokardan ikinji we üçünji doly ösen ýapraklar) peroksisomal katalaza (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoksid dismutaza (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) we glutation reduktaza (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) ýaly üç antioksidant bilen baglanyşykly geniň transkript derejelerini anyklamak üçin real wagt RT-PCR ulanyldy. Gysgaça aýdylanda, RNK öndürijiň protokolyna laýyklykda Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Hytaý) ulanylyp bölünip alyndy. Soňra öndürijiň görkezmelerine laýyklykda TOP script™ cDNA Synthesis Kit ulanylyp kDNK sintez edildi. Ýokardaky üç geniň praýmer yzygiderlilikleri Goşmaça S3 tablisasynda görkezilen. Öý hojalygynyň geni hökmünde PvActin-3 (GenBank giriş belgisi: XM_068616709.1) ulanyldy we gen ekspresiýasy 2-ΔΔCT usuly arkaly hasaplandy (Livak we Schmittgen, 2001). Biotiki stressde (adaty baklažly ösümlikler bilen antraknoz kömelekleri Colletotrichum lindemuthianum arasyndaky gabat gelmeýän özara täsir) we abiotik stressde (guraklyk, duzlulyk, pes temperatura) aktiniň durnuklylygy görkezildi (Borges we beýlekiler, 2012).
Ilki bilen biz S. sclerotiorum-daky oksaloasetat asetilgidrolaza (OAH) beloklarynyň genom boýunça kremniý analizini belok-belok BLAST guralyny (BLASTp 2.15.0+) ulanyp geçirdik (Altschul we beýlekiler, 1997, 2005). Gysgaça aýdylanda, biz S. sclerotiorum-daky gomologik belogy (taksid: 5180) kartalaşdyrmak üçin sorag yzygiderliligi hökmünde Aspergillus fijiensis CBS 313.89-dan (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank giriş belgisi XP_040799428.1; 342 aminokislotalar) we Penicillium lagena-dan (PlOAH; taxide: 94218; GenBank giriş belgisi XP_056833920.1; 316 aminokislotalar) OAH ulandyk. BLASTp, Milli Biotehnologiýa Maglumat Merkeziniň (NCBI) web sahypasyndaky (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBank-da iň soňky elýeterli S. sclerotiorum genom maglumatlaryna garşy geçirildi.
Mundan başga-da, S. sclerotiorum-dan çaklanylýan OAH geni (SsOAH) we A. fijiensis CBS 313.89-dan AfOAH-yň we P. lagena-dan PlOAH-yň ewolýusiýa seljermesi we filogenetik agajy MEGA11-de (Tamura we beýlekiler, 2021) we JTT matrisa esasly modelde (Jones we beýlekiler, 1992) iň ýokary ähtimallyk usuly arkaly çykaryldy. Filogenetik agaç S. sclerotiorum-dan çaklanylýan ähli OAH genleriniň (SsOAH) belok yzygiderlikleriniň köptaraplaýyn deňleşdirme seljermesi we Çäklendirme esasly deňleşdirme guralyny (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) ulanyp sorag yzygiderligi bilen birleşdirildi (Papadopoulos we Agarwala, 2007). Mundan başga-da, S. sclerotiorum-dan alnan SsOAH-yň iň gowy gabat gelýän aminokislota yzygiderlilikleri ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ulanyp sorag yzygiderlilikleri (AfOAH we PlOAH) bilen deňleşdirildi (Larkin we beýlekiler, 2007) we deňleşdirmede saklanan sebitler ESPript guraly (3.0 wersiýasy; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) arkaly wizuallaşdyryldy.
Mundan başga-da, S. sclerotiorum SsOAH-nyň çaklanylýan funksional wekilçilikli domenleri we saklanýan ýerleri InterPro guralyny (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) ulanyp dürli maşgalalara interaktiw görnüşde klassifikasiýa edildi (Blum we beýlekiler, 2021). Ahyrsoňy, çaklanylýan S. sclerotiorum SsOAH-nyň üç ölçegli (3D) gurluş modelirlemesi Protein Homologiýasy/Analogiýa Tanyşlyk Dwigatelini (Phyre2 serwer wersiýasy 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley we beýlekiler, 2015) ulanyp ýerine ýetirildi we SWISS-MODEL serwerini (https://swissmodel.expasy.org/) ulanyp tassyklanyldy (Biasini we beýlekiler, 2014). Çaklanylýan üç ölçegli gurluşlar (PDB formaty) UCSF-Chimera bukjasyny (1.15 wersiýasy; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ulanyp interaktiw görnüşde görkezildi (Pettersen we beýlekiler, 2004).
Sclerotinia sclerotiorum miseliýalarynda oksaloasetat asetilgidrolazanyň (SsOAH; GenBank giriş belgisi: XM_001590428.1) transkripsiýa derejesini kesgitlemek üçin mukdary hakyky wagt fluoresensiýa PZR ulanyldy. Gysgaça aýdylanda, S. sclerotiorum PDB saklaýan kolba içine sanjyldy we 25 ± 2 °C temperaturada 24 sagatlap 150 aýlaw/minutda we yzygiderli garaňkylykda (24 sagat) miseliýanyň ösüşini höweslendirmek üçin çaýkaýan inkubatora (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABŞ) ýerleşdirildi. Şondan soň, öýjükler soňky IC50 konsentrasiýalarynda (degişlilikde takmynan 40 we 3,2 mg/L) L-ornitin we fungisid Rizolex-T bilen işlenildi we soňra şol bir şertlerde ýene 24 sagat ösdürilip ýetişdirildi. Inkubasiýadan soň, medeniýetler 2500 aýlaw/minut tizlikde 5 minutlap santrifuga edildi we üstki gatlak (gömelek miseli) gen ekspresiýasyny seljermek üçin ýygnaldy. Şonuň ýaly-da, gömelek miseli infeksiýadan soň 0, 24, 48, 72, 96 we 120 sagatda infeksiýadan soň infeksiýa dokumalarynyň ýüzünde ak küýze we pagta miseli emele getiren infeksiýaly ösümliklerden ýygnaldy. RNK gömelek miseliýinden alyndy we soňra ýokarda beýan edilişi ýaly kDNK sintez edildi. SsOAH üçin praýmer yzygiderlikleri S3 goşmaça tablisasynda görkezilen. SsActin (GenBank giriş belgisi: XM_001589919.1) öý hojalygynyň geni hökmünde ulanyldy we deňeşdirilen gen ekspresiýasy 2-ΔΔCT usuly arkaly hasaplanyldy (Livak we Schmittgen, 2001).
Oksalat turşusy kartoşka dekstroza şorbasynda (PDB) we kömelek kesel döredijisi Sclerotinia sclerotiorum bolan ösümlik nusgalarynda kiçi üýtgetmeler bilen kesgitlendi. Gysgaça aýdylanda, S. sclerotiorum izolýatlary PDB bolan kolbalara sanjym edildi we soňra miseliýanyň ösüşini höweslendirmek üçin 25 ± 2 °C-de 150 aýlaw/minutda 3-5 günläp yzygiderli garaňkylykda (24 sagat) titräp inkubatorda (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABŞ) ösdürilip ýetişdirildi. Inkubasiýadan soň, kömelek medeniýeti ilki Whatman #1 süzgüç kagyzyndan süzüldi we soňra galan miselini aýyrmak üçin 2500 aýlaw/minutda 5 minutlap santrifuga edildi. Üstki gatlak ýygnaldy we oksalatyň mukdaryny has anyklamak üçin 4 °C-de saklandy. Ösümlik nusgalaryny taýýarlamak üçin takmynan 0,1 g ösümlik dokumalarynyň bölekleri distilled suw bilen üç gezek çykaryldy (her gezek 2 ml). Soňra nusgalar 2500 aýlan/minut tizlikde 5 minutlap santrifuga edildi, üstki suwuklyk Whatman №1 süzgüç kagyzyndan gurak süzgüçden geçirildi we goşmaça seljerme üçin ýygnaldy.
Oksalat kislotasynyň mukdaryny seljermek üçin reaksiýa garyndysy aýna dykylýan turbada aşakdaky tertipde taýýarlanyldy: 0,2 ml nusga (ýa-da PDB medeniýet filtraty ýa-da oksalat kislotasynyň standart ergini), 0,11 ml bromofenol gök (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburg, PA, ABŞ), 0,198 ml 1 M kükürt kislotasy (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Müsür) we 0,176 ml 100 mM kaliý dihromaty (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ABŞ), soňra ergin distilled suw bilen 4,8 ml-e çenli suwlandyryldy, güýçli garyşdyryldy we derrew 60 °C suw wannasyna goýuldy. 10 minutdan soň, reaksiýa 0,5 ml natriý gidroksid ergini (NaOH; 0,75 M) goşmak bilen togtadyldy. Reaksiýa garyndysynyň siňdirilişi (A600) 600 nm-de UV-160 spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Ýaponiýa) arkaly ölçeldi. Deňeşdirilip, medeniýet filtratlarynyň we ösümlik nusgalarynyň mukdaryny kesgitlemek üçin gözegçilik hökmünde PDB we distilled suw ulanyldy. Medeniýet filtratlaryndaky oksalat kislotasynyň konsentrasiýalary, PDB gurşawynyň millilitrine düşýän oksalat kislotasynyň mikrogramlary (μg.mL−1) we ýaprak ekstraktlarynda, täze agramyň gramyna düşýän oksalat kislotasynyň mikrogramlary (μg.g−1 FW) hökmünde görkezilen, oksalat kislotasynyň kalibrleme egrisi (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) arkaly kesgitlenildi.
Barlagyň dowamynda ähli tejribeler, başgaça görkezilmedik bolsa, her bejergi üçin alty biologik gaýtalama we her biologik gaýtalama üçin bäş küýze (küýzede iki ösümlik) bilen doly tötänleýin dizaýn (CRD) görnüşinde döredildi. Biologik gaýtalamalar iki gezek seljerildi (iki tehniki gaýtalama). Şol bir tejribede gaýtalanmagy barlamak üçin tehniki gaýtalamalar ulanyldy, ýöne galp gaýtalamalardan gaça durmak üçin statistik seljermede ulanylmady. Maglumatlar üýtgeşiklik seljermesi (ANOVA) we soňra Tukey-Kramer hakykatdanam möhüm tapawut (HSD) synagy (p ≤ 0.05) ulanylyp statistik taýdan seljerildi. In vitro tejribeler üçin IC50 we IC99 gymmatlyklary probit modeli arkaly hasaplandy we 95% ynam aralyklary hasaplanyldy.
Müsüriň El-Ghabiýa gubernatorlygyndaky dürli soýa meýdanlaryndan jemi dört izolýat ýygnaldy. PDA gurşawynda ähli izolýatlar krem ​​reňkli ak miseliý öndürdi, ol çalt pagta reňkli ak reňke öwrüldi (1A surat) we soňra sklerotium tapgyrynda bež ýa-da goňur reňke öwrüldi. Sklerotiýalar adatça dykyz, gara, togalak ýa-da düzgünsiz görnüşde bolýar, uzynlygy 5,2-den 7,7 mm-e çenli we diametri 3,4-den 5,3 mm-e çenli bolýar (1B surat). Dört izolýat 25 ± 2 °C-de 10-12 günlük inkubasiýadan soň medeniýet gurşawyň gyrasynda sklerotiýanyň çetki nusgasyny döretse-de (1A surat), olaryň arasynda her bir tarelkadaky sklerotiýanyň sany düýpli tapawutlandy (P < 0,001), 3-nji izolýatda iň köp sklerotiýanyň sany bardy (tarelkadaky 32,33 ± 1,53 sklerotiýa; 1C surat). Şonuň ýaly-da, izolýat #3 beýleki izolýatlara garanyňda PDB-de has köp oksalat kislotasyny öndürdi (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; 1D surat). Izolýat #3 fitopatogen kömelek Sclerotinia sclerotiorum-yň tipik morfologiki we mikroskopiki aýratynlyklaryny görkezdi. Mysal üçin, PDA-da izolýat #3-iň koloniýalary çalt ösdi, krem ​​reňkli ak (1A surat), ters bež ýa-da açyk losos sary-goňur reňkde boldy we 9 sm diametrli plastinkanyň ýüzüni doly örtmek üçin 25 ± 2°C-de 6-7 gün gerek boldy. Ýokardaky morfologiki we mikroskopiki häsiýetlere esaslanyp, izolýat #3 Sclerotinia sclerotiorum hökmünde kesgitlenildi.
Surat 1. Umumy baklagil ekinlerinden alynýan S. sclerotiorum izolýatlarynyň häsiýetnamalary we patogenligi. (A) PDA gurşawynda dört S. sclerotiorum izolýatynyň miseliýal ösüşi, (B) dört S. sclerotiorum izolýatynyň sklerotiýasy, (C) sklerotiýalaryň sany (her bir tarelkada), (D) PDB gurşawynda oksalat turşusynyň bölünip çykmagy (μg.mL−1) we (E) ýyladyşhana şertlerinde duýgur täjirçilik baklagil sortunda dört S. sclerotiorum izolýatynyň keseliň agyrlygy (%). Bahalar bäş biologik gaýtalanmanyň ortaça ± SD-ni görkezýär (n = 5). Dürli harplar bejerişleriň arasyndaky statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär (p < 0.05). (F–H) Adaty ak küýze alamatlary, degişlilikde, 3-nji izolýat (dpi) bilen sanjymdan 10 gün soň, ýerüsti sapaklarda we silikalarda peýda boldy. (I) S. sclerotiorum izolýaty #3-iň içki transkripsiýa edilen aralyk (ITS) sebitiniň ewolýusiýa seljermesi iň ýokary ähtimallyk usuly arkaly geçirildi we Milli Biotehnologiýa Maglumat Merkeziniň (NCBI) maglumatlar bazasyndan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) alnan 20 sany salgylanma izolýaty/ştammy bilen deňeşdirildi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Klasterleme çyzyklarynyň ýokarsyndaky sanlar sebitiň örtügini (%), klasterleme çyzyklarynyň aşagyndaky sanlar bolsa şahanyň uzynlygyny görkezýär.
Mundan başga-da, patogenligi tassyklamak üçin, alnan dört sany S. sclerotiorum izolýaty, duýgur täjirçilik noýba sortuny Giza 3-i ýyladyşhana şertlerinde sanjym etmek üçin ulanyldy, bu bolsa Kohyň postulatlaryna laýyk gelýär (1E surat). Alnan ähli kömelek izolýatlary patogen bolup, ýaşyl noýbany ýokuşdyryp bilse-de (Giza 3-e meňzeş), sanjymdan 10 gün soň (dpi) ähli ýerüsti böleklerde (1F surat), esasanam sapaklarda (1G surat) we kapsulalarda (1H surat) adaty ak küýze alamatlaryny döredip bilse-de, izolýat 3 iki garaşsyz synagda iň agressiw izolýat boldy. 3-nji izolýat noýba ösümliklerinde iň ýokary kesel agyrlygyna (%) eýe boldy (infeksiýadan 7, 14 we 21 gün soň degişlilikde 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 we 76.7 ± 3.1; 1F surat).
Iň inwaziw S. sclerotiorum izolýaty #3-iň anyklanmagy içki transkripsiýa edilen aralyk (ITS) yzygiderliligine esaslanyp has-da tassyklanyldy (1I surat). 3-nji izolýat bilen 20 sany salgylanma izolýatlarynyň/ştamlarynyň arasyndaky filogenetiki seljerme olaryň arasynda ýokary meňzeşligi (>99%) görkezdi. S. sclerotiorum izolýaty #3-iň (533 bp) gurak nohut tohumlaryndan bölünip alnan amerikan S. sclerotiorum izolýaty LPM36 (GenBank giriş belgisi MK896659.1; 540 bp) we hytaý S. sclerotiorum izolýaty YKY211 (GenBank giriş belgisi OR206374.1; 548 bp) bilen ýokary meňzeşlige eýedigini bellemek gerek, bu bolsa dendrogrammanyň ýokarsynda aýratynlykda toparlanan benewşe (Matthiola incana) kök çüýremegine sebäp bolýar (1I surat). Täze yzygiderlik NCBI maglumat bazasyna ýerleşdirilip, “Sclerotinia sclerotiorum – izolýat YN-25” (GenBank giriş belgisi PV202792) diýlip atlandyryldy. 3-nji izolýatyň iň inwaziw izolýatdygyny görmek bolýar; şonuň üçin bu izolýat ähli soňky tejribelerde öwrenmek üçin saýlandy.
Diamin L-ornitiniň (Sigma-Aldrich, Darmştadt, Germaniýa) dürli konsentrasiýalarda (12.5, 25, 50, 75, 100 we 125 mg/L) S. sclerotiorum izolýaty 3-e garşy antibakterial işjeňligi in vitro öwrenildi. L-ornitiniň antibakterial täsir edendigini we doza bagly görnüşde S. sclerotiorum hyphae-niň radial ösüşini ýuwaş-ýuwaşdan basyp ýatyrandygy bellärliklidir (2A, B surat). Synag edilen iň ýokary konsentrasiýada (125 mg/L) L-ornitin iň ýokary miseliýa ösüşiniň basyp ýatyrma tizligini (99.62 ± 0.27%; 2B surat) görkezdi, bu bolsa synag edilen iň ýokary konsentrasiýada (10 mg/L) söwda fungisidi Rizolex-T-e deň boldy (bagyşlaýyş tizligi 99.45 ± 0.39%; 2C surat), bu bolsa meňzeş netijeliligi görkezýär.
Surat 2. L-ornitiniň Sclerotinia sclerotiorum-a garşy in vitro antibakterial işjeňligi. (A) L-ornitiniň dürli konsentrasiýalarynyň S. sclerotiorum-a garşy antibakterial işjeňliginiň söwda fungisidi Rizolex-T (10 mg/L) bilen deňeşdirilmegi. (B, C) L-ornitiniň dürli konsentrasiýalary (12.5, 25, 50, 75, 100 we 125 mg/L) ýa-da Rizolex-T (2, 4, 6, 8 we 10 mg/L) bilen bejergiden soň S. sclerotiorum miseliýa ösüşiniň basylyp saklanma derejesi (%). Bahalar bäş biologik gaýtalanmanyň ortaça ± SD-ni görkezýär (n = 5). Dürli harplar bejergileriň arasyndaky statistik tapawutlary görkezýär (p < 0.05). (D, E) Degişlilikde L-ornitiniň we söwda fungisidi Rizolex-T-niň probit model regressiýa analizi. Probit modeliniň regressiýa çyzygy berk gök çyzyk, ynam aralygy bolsa (95%) gyzyl çyzyk hökmünde görkezilýär.
Mundan başga-da, probit regressiýa analizi geçirildi we degişli grafikler 1-nji tablisada we 2D, E suratlarynda görkezilýär. Gysgaça aýdylanda, L-ornitiniň kabul ederlikli eňňit gymmaty (y = 2.92x − 4.67) we degişli möhüm statistikalar (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 we p < 0.0001; 2D surat) söwda fungisidi Rizolex-T bilen deňeşdirilende (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 we p < 0.0001) S. sclerotiorum-a garşy antifungal işjeňligiň ýokarlanandygyny görkezdi (1-nji tablisa).
1-nji tablisa. S. sclerotiorum-a garşy L-ornitiniň we täjirçilik fungisidi “Rizolex-T”-niň ýarym-maksimal inhibitiw konsentrasiýasynyň (IC50) we IC99 (mg/l) gymmatlyklary.
Umuman alanyňda, L-ornitin (250 mg/L) bejerilmedik S. sclerotiorum bilen ýokançlanan ösümliklere garanyňda, bejerilen umumy noýba ösümliklerinde ak kömelek keseliniň ösüşini we agyrlygyny ep-esli azaldy (gözegçilik; 3A surat). Gysgaça aýdylanda, bejerilmedik ýokançlanan gözegçilik ösümlikleriniň keseliniň agyrlygy kem-kemden artsa-da (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 we 92.33 ± 3.06%), L-ornitin synagyň dowamynda keseliň agyrlygyny (%) ep-esli azaldy (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 we 26.36 ± 3.07) bejergiden soň degişlilikde 7, 14 we 21 günden soň (dpt) (3A surat). Şonuň ýaly-da, S. sclerotiorum bilen ýokuşan noýba ösümlikleri 250 mg/L L-ornitin bilen bejerilende, keseliň ösüş egrisiniň aşagyndaky meýdan (AUDPC) bejerilmedik gözegçilikde 1274.33 ± 33.13-den 281.03 ± 7.95-e çenli azaldy, bu bolsa oňyn gözegçilik 50 mg/L Rizolex-T fungisidiniňkiden birneme pesdi (183.61 ± 7.71; 3B surat). Ikinji tejribede hem şol bir meýil syn edildi.
Surat 3. L-ornitiniň ekzogen ulanylmagynyň parnik şertlerinde Sclerotinia sclerotiorum sebäpli adaty noýbanyň ak çüýremesiniň ösüşine täsiri. (A) 250 mg/L L-ornitin bilen bejerilenden soň adaty noýbanyň ak küýzesiniň kesel ösüş egrisi. (B) L-ornitin bilen bejerilenden soň adaty noýbanyň ak küýzesiniň kesel ösüş egrisi (AUDPC) astyndaky meýdan. Bahalar bäş biologik gaýtalanmanyň ortaça ± SD-ni görkezýär (n = 5). Dürli harplar bejerişleriň arasyndaky statistik taýdan ähmiýetli tapawutlary görkezýär (p < 0.05).
250 mg/L L-ornitiniň ekzogen ulanylmagy 42 günden soň ösümligiň boýyny (4A surat), her ösümlikde şahalaryň sanyny (4B surat) we her ösümlikde ýapraklaryň sanyny (4C surat) kem-kemden ýokarlandyrdy. Söwda fungisidi Rizolex-T (50 mg/L) öwrenilen ähli iýmit parametrlerine iň uly täsir eden bolsa, 250 mg/L L-ornitiniň ekzogen ulanylmagy bejerilmedik gözegçilik toparyna garanyňda ikinji uly täsir etdi (4A–C suratlar). Beýleki tarapdan, L-ornitin bilen bejergi fotosintetik pigmentler hlorofil a (4D surat) we hlorofil b (4E surat) mukdaryna düýpli täsir etmedi, ýöne karotinoidleriň umumy mukdaryny (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) negatiw gözegçilik (0,44 ± 0,02 mg/g fr wt) we oňyn gözegçilik (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; 4F surat) bilen deňeşdirilende biraz ýokarlandyrdy. Umuman, bu netijeler L-ornitiniň bejerilen baklagiller üçin fitotoksik däldigini we hatda olaryň ösüşini höweslendirip biljekdigini görkezýär.
Surat 4. Ekzogen L-ornitiniň ulanylmagynyň ýyladyşhana şertlerinde Sclerotinia sclerotiorum bilen ýokançlanan noýba ýapraklarynyň ösüş aýratynlyklaryna we fotosintetik pigmentlerine täsiri. (A) Ösümligiň beýikligi (sm), (B) Her ösümligiň şahalarynyň sany, (C) Her ösümligiň ýapraklarynyň sany, (D) Hlorofil a-nyň mukdary (mg g-1 fr wt), (E) Hlorofil b-niň mukdary (mg g-1 fr wt), (F) Jemi karotinoid mukdary (mg g-1 fr wt). Bahalar bäş biologik gaýtalanmanyň ortaça ± SD-sidir (n = 5). Dürli harplar bejerişleriň arasyndaky statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär (p < 0.05).
Reaktiw kislorod görnüşleriniň (ROS; wodorod peroksidi [H2O2] hökmünde beýan edilýär) we erkin radikallaryň (superoksid anionlary [O2•−] hökmünde beýan edilýär) in situ gistohimiki lokalizasiýasynda L-ornitiniň (250 mg/L) ekzogen ulanylmagynyň, bejerilmedik ýokançly ösümlikleriň (degişlilikde 173.31 ± 12.06 we 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) we 50 mg/L söwda fungisidi Rizolex-T bilen bejerilen ösümlikleriň (degişlilikde 170.12 ± 9.50 we 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) toplanmagy bilen deňeşdirilende, H2O2-niň (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; 5A surat) we O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; 5B surat) toplanmagyny ep-esli azaltdygyny ýüze çykardy. 72 sagatda. Hpt astynda ýokary derejede H2O2 we O2•− toplandy (5A, B surat). Şonuň ýaly-da, TCA esasyndaky malondialdegid (MDA) synagy S. sclerotiorum bilen ýokuşan noýba ösümlikleriniň ýapraklarynda MDA-nyň ýokary derejesini (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) toplandygyny görkezdi (5C surat). Şeýle-de bolsa, L-ornitiniň ekzogen ulanylmagy lipid peroksidleşmesini ep-esli azaldy, munuň subutnamasy bejerilen ösümliklerde MDA-nyň mukdarynyň azalmagydyr (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Surat 5. Ekzogen L-ornitiniň ulanylmagynyň parnik şertlerinde ýokançlykdan 72 sagat soň S. sclerotiorum bilen ýokançlanan noýba ýapraklarynda oksidatiw stressiň we fermentatiw däl antioksidant gorag mehanizmleriniň esasy alamatlaryna täsiri. (A) 72 at güýjünde wodorod peroksid (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 at güýjünde superoksid aniony (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 at güýjünde malondialdegid (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 at güýjünde jemi ereýän fenollaryň sany (mg GAE g−1 FW), (E) 72 at güýjünde jemi ereýän flavonoidleriň sany (mg RE g−1 FW), (F) 72 at güýjünde jemi erkin aminokislotalaryň sany (mg g−1 FW) we (G) 72 at güýjünde prolin mukdary (mg g−1 FW). Bahalar 5 biologik gaýtalanmanyň ortaça ± standart çetleşmesini (ortaça ± SD) görkezýär (n = 5). Dürli harplar bejeriş usullarynyň arasyndaky statistik taýdan möhüm tapawutlary görkezýär (p < 0.05).