Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS üçin çäkli goldaw bar. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de utgaşyklylyk režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, goldawy dowam etdirmegi üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Ýokary ýüklenme mukdary bolan insulin nanopartikullary (NP) dürli doza görnüşlerinde dürli ulanylyşlary tapdy. Bu iş doňduryp guratmak we püskürtmek arkaly guratmak prosesleriniň insulin ýüklenen hitosan nanopartikullarynyň gurluşyna täsirini bahalandyrmagy maksat edinýär, krioprotektor hökmünde mannitol bilen ýa-da onsuz. Şeýle hem, biz bu nanopartikullaryň hilini olary gaýtadan eredip bahaladyk. Suwsuzlandyrmadan öň, hitosan / natriý tripolifosfat / insulin özara baglanyşykly nanopartikullaryň bölejikleriniň ululygy 318 nm, PDI 0,18, kapsulasiýanyň netijeliligi 99,4% we ýükleme 25,01% boldy. Dikeldilenden soň, mannitol ulanmazdan doňduryp guratmak usuly bilen öndürilenlerden başga ähli nanopartikullar öz sferiki bölejikleriniň gurluşyny sakladylar. Iki püskürtmek arkaly guradylan mannitol saklaýan nanopartikullar bilen deňeşdirilende, mannitolsyz püskürtmek arkaly guradylan nanopartikullar hem iň kiçi ortaça bölejik ululygyny (376 nm) we iň ýokary ýükleme görkezdi. mazmun (25.02%), meňzeş kapsulalaşdyrma tizligi (98.7%) we PDI (0.20) bilen guradylan ýa-da doňduryp guradylan usullar arkaly. Mannitolsyz püskürdip guradylan nanopartikullar insuliniň iň çalt bölünip çykmagyna we öýjükleriň özleşdirilmeginiň iň ýokary netijeliligine getirdi. Bu iş püskürdip guradylan insuliniň nanopartikullaryny adaty doňduryp guradylan usullara garanyňda krioprotektorlara mätäçlik bolmazdan suwsuzlandyryp biljekdigini, has uly ýükleme kuwwatyny, pes goşundy talaplaryny we işleýiş çykdajylaryny döredýändigini görkezýär. Bu uly artykmaçlykdyr.
1922-nji ýylda açylandan bäri21,2,3, insulin we onuň derman serişdeleri 1-nji tip diabet (T1DM) we 2-nji tip diabet (T1DM) bilen kesellän näsaglaryň janyny halas etdi. Şeýle-de bolsa, ýokary molekulýar agramly belok hökmündäki häsiýetleri sebäpli insulin aňsatlyk bilen agregasiýa edilýär, proteolitik fermentler tarapyndan bölünýär we ilkinji geçiş täsiri bilen ýok edilýär. 1-nji tip diabet bilen kesellän adamlara ömrüniň ahyryna çenli insulin inýeksiýalary gerek. Ilki başda 2-nji tip diabet bilen kesellän näsaglaryň köpüsine uzak möhletli insulin inýeksiýalary hem gerek. Gündelik insulin inýeksiýalary bu adamlar üçin gündelik agyry we rahatsyzlyk çeşmesi bolup, ruhy saglyga ýaramaz täsir edýär. Netijede, insuliniň agyz arkaly berilmegi ýaly az rahatsyzlyk döredýän beýleki insulin berliş görnüşleri giňden öwrenilýär5, sebäbi olar dünýäde takmynan 5 milliard diabet bilen kesellän adamyň ýaşaýyş hilini dikeltmek mümkinçiligine eýedir.
Nanopartikul tehnologiýasy agyz arkaly insulin kabul etmek synanyşyklarynda uly öňegidişlik döretdi4,6,7. Insulini bedeniň belli bir ýerlerine maksatly eltip bermek üçin dargamakdan netijeli kapsulalaşdyrýan we goraýan tehnologiýa. Şeýle-de bolsa, nanopartikul formulalaryny ulanmagyň birnäçe çäklendirmeleri bar, esasan hem bölejikleriň suspenziýalarynyň durnuklylyk meseleleri sebäpli. Saklamak wagtynda käbir agregasiýalar bolup biler, bu bolsa insulin ýüklenen nanopartikullaryň bioelýeterliligini peseldýär8. Mundan başga-da, insulin nanopartikullarynyň (NP) durnuklylygyny üpjün etmek üçin nanopartikullaryň we insuliniň polimer matrisasynyň himiki durnuklylygyny hem göz öňünde tutmaly. Häzirki wagtda doňduryp guratmak tehnologiýasy saklamak wagtynda islenilmeýän üýtgeşmeleriň öňüni almak bilen durnukly NP döretmek üçin altyn standartdyr9.
Şeýle-de bolsa, doňduryp guratmak üçin NP-leriň sferiki gurluşynyň buz kristallarynyň mehaniki stresiniň täsirine düşmeginiň öňüni almak üçin krioprotektorlaryň goşulmagy zerurdyr. Bu, krioprotektor agram gatnaşygynyň köp bölegini eýeleýändigi sebäpli, liofilizasiýadan soň insulin nanopartikullarynyň ýüklenmesini ep-esli azaldýar. Şonuň üçin, öndürilen insulin NP-leri köplenç agyz tabletkalary we agyz plyonkalary ýaly gurak poroşok formulalaryny öndürmek üçin ýaramsyz hasaplanýar, sebäbi insuliniň terapewtiki penjiresine ýetmek üçin köp mukdarda gurak nanopartikullaryň zerurlygy ýüze çykýar.
Spreý guradyş derman senagatynda suwuk fazalardan gurak poroşoklary öndürmek üçin meşhur we arzan senagat möçberindäki prosesdir10,11. Bölejikleriň emele gelmegi prosesine gözegçilik etmek birnäçe bioaktiw birleşmeleriň 12, 13 dogry kapsulasiýasyna mümkinçilik berýär. Mundan başga-da, ol agyzdan kabul etmek üçin kapsulalanan beloklary taýýarlamak üçin netijeli usula öwrüldi. Spreý guradyş wagtynda suw örän çalt buharlanýar, bu bolsa bölejik ýadrosynyň temperaturasyny pes saklamaga kömek edýär11,14, bu bolsa onuň ýylylyga duýgur komponentleri kapsulalaşdyrmak üçin ulanylmagyna mümkinçilik berýär. Spreý guradyşdan öň, örtük materialy kapsulalanan ingredientleri öz içine alýan ergin bilen doly gomogenleşdirilmelidir11,14. Doňduryp guradyşdan tapawutlylykda, spreý guradyşda kapsulalaşdyrmadan öň gomogenleşdirme suwsuzlandyryş wagtynda kapsulasiýanyň netijeliligini ýokarlandyrýar. Spreý guradyş kapsulalaşdyrma prosesi krioprotektorlary talap etmeýändigi sebäpli, spreý guradyş ýokary ýüklenme mukdary bolan guradylan NP-leri öndürmek üçin ulanylyp bilner.
Bu gözlegde hitosan we natriý tripolifosfatyň ion gel usuly arkaly özara baglanyşygy arkaly insulin ýüklenen NP-leriň öndürilişi barada habar berilýär. Ion gelleşdirmesi belli bir şertlerde iki ýa-da has köp ion görnüşleriniň arasyndaky elektrostatik özara täsirler arkaly nanopartikullaryň öndürilmegine mümkinçilik berýän taýýarlamak usulydyr. Optimallaşdyrylan hitosan/natriý tripolifosfat/insulin özara baglanyşygy bolan nanopartikullary suwsuzlandyrmak üçin doňduryp guratmak we püskürdip guratmak usullary ulanyldy. Suwsuzlandyrylandan soň, olaryň morfologiýasy SEM arkaly seljerildi. Olaryň rekombinasiýa ukyby olaryň ölçeg paýlanyşyny, ýüzleý zarýadyny, PDI-ni, kapsulasiýanyň netijeliligini we ýükleme mazmunyny ölçemek arkaly bahalandyryldy. Dürli suwsuzlandyryş usullary bilen öndürilen gaýtadan ereýän nanopartikullaryň hili hem olaryň insulin goragyny, boşadylyş häsiýetini we öýjükleriň özleşdiriş netijeliligini deňeşdirmek arkaly bahalandyryldy.
Garyşyk erginiň pH derejesi we hitosan bilen insuliniň gatnaşygy soňky NP-leriň bölejikleriniň ululygyna we kapsulasiýanyň netijeliligine (EE) täsir edýän iki esasy faktordyr, sebäbi olar gönüden-göni ionotropik gelleşme prosesine täsir edýär. Garyşyk erginiň pH derejesi bölejikleriň ululygy we kapsulasiýanyň netijeliligi bilen ýokary derejede baglanyşyklydygy görkezildi (1a-njy surat). 1a-njy suratda görkezilişi ýaly, pH 4.0-dan 6.0-a çenli ýokarlananda, ortaça bölejikleriň ululygy (nm) kiçeldi we EE ep-esli artdy, pH 6.5-e çenli ýokarlananda bolsa, ortaça bölejikleriň ululygy artmaga başlady we EE üýtgewsiz galdy. Hitosanyň insuline gatnaşygy artanda, ortaça bölejikleriň ululygy hem artýar. Mundan başga-da, nanopartikullar hitosan/insuliniň 2.5:1-den (w/w) ýokary massa gatnaşygynda taýýarlanylanda EE-de hiç hili üýtgeşiklik syn edilmedi (1b-nji surat). Şonuň üçin bu gözlegde iň gowy taýýarlamak şertleri (pH 6.0, hitosan/insuliniň massa gatnaşygy 2.5:1) insulin ýüklenen nanopartikullary mundan beýläk öwrenmek üçin taýýarlamak üçin ulanyldy. Bu taýýarlamak şertinde insulin nanopartikullarynyň ortaça bölejik ölçegi 318 nm (1c-nji surat), PDI 0,18, ýerleşdiriş netijeliligi 99,4%, zeta potensialy 9,8 mv we insulin ýüklenmesi 25,01% (m/m) boldy. Geçiriş elektron mikroskopiýasynyň (TEM) netijelerine esaslanyp, optimizirlenen nanopartikullar takmynan sferiki we diskret, deňeşdirme boýunça deň ölçegli boldy (1d-nji surat).
Insulin nanopartikullarynyň parametr optimizasiýasy: (a) pH-yň insulin nanopartikullarynyň ortaça diametrine we kapsulasiýanyň netijeliligine (EE) täsiri (hitosan we insuliniň 5:1 massa gatnaşygynda taýýarlanan); (b) hitosan we insuliniň massa gatnaşygynyň insulin NP-leriniň ortaça diametrine we kapsulasiýanyň netijeliligine (EE) täsiri (pH 6-da taýýarlanan); (c) optimizirlenen insulin nanopartikullarynyň bölejik ululygynyň paýlanyşy; (d) optimizirlenen insulin NP-leriniň TEM mikrografiýasy.
Hitosanyň pKa-sy 6,5 bolan gowşak polielektrolitdigi mälim. Onuň esasy amino topary wodorod ionlary bilen protonlaşdyrylýandygy sebäpli, ol kislotaly gurşawda oňyn zarýadlanýar15. Şonuň üçin ol köplenç negatiw zarýadly makromolekulalary kapsulalaşdyrmak üçin daşaýjy hökmünde ulanylýar. Bu gözlegde hitosan 5,3 izoelektrik nokady bolan insulini kapsulalaşdyrmak üçin ulanyldy. Hitosan örtük materialy hökmünde ulanylandygy sebäpli, onuň paýynyň artmagy bilen nanopartikullaryň daşky gatlagynyň galyňlygy degişlilikde artýar, bu bolsa ortaça bölejik ölçeginiň has uly bolmagyna getirýär. Mundan başga-da, hitosanyň ýokary derejesi has köp insulini kapsulalaşdyryp biler. Biziň ýagdaýymyzda, hitosan bilen insuliniň gatnaşygy 2,5:1-e ýetende EE iň ýokary boldy we gatnaşyk artýança EE-de düýpli üýtgeşiklik bolmady.
Hitosan we insuliniň gatnaşygyndan başga-da, pH hem NP-leri taýýarlamakda möhüm rol oýnady. Gan we beýlekiler 17 pH-yň hitosan nanopartikullarynyň bölejikleriniň ölçegine täsirini öwrendiler. Olar pH 6.0-a ýetýänçä bölejikleriň ölçegleriniň üznüksiz azalýandygyny we pH > 6.0-da bölejikleriň ölçegleriniň ep-esli artandygyny anykladylar, bu bolsa biziň gözegçiliklerimize laýyk gelýär. Bu hadysa, pH-yň ýokarlanmagy bilen insulin molekulasynyň ters ýüz zarýadyny almagy bilen baglanyşyklydyr, şeýlelik bilen hitosan/natriý tripolifosfat (TPP) toplumy bilen elektrostatik özara täsirleşmäge mümkinçilik berýär, bu bolsa kiçi bölejikleriň ölçegine we ýokary EE-e getirýär. Şeýle-de bolsa, pH 6.5-e sazlananda, hitosandaky amino toparlar deprotonlaşdyryldy, bu bolsa hitosan bükülmegine getirdi. Şeýlelik bilen, ýokary pH amino ionlarynyň TPP we insuline az täsir etmegine getirýär, bu bolsa has pes çarpaz baglanyşyk, has uly soňky ortaça bölejikleriň ölçegine we has pes EE-e getirýär.
Doňdurylyp guradylan we püskürtülip guradylan NP-leriň morfologik häsiýetleriniň seljermesi has gowy suwsuzlandyrma we poroşok emele getirme usullaryny saýlamaga ýol görkezip biler. Iň gowy usul dermanyň durnuklylygyny, birmeňzeş bölejik görnüşini, ýokary derman ýüklenmesini we asyl ergininde gowy erimegini üpjün etmelidir. Bu gözlegde, iki usuly has gowy deňeşdirmek üçin, suwsuzlandyrma wagtynda 1% mannitolly ýa-da bolmadyk insulin NP-leri ulanyldy. Mannitol doňdurylyp guradylan we püskürtülip guradylan dürli gurak poroşok formulalarynda göwrümleşdiriji serişde ýa-da krioprotektor hökmünde ulanylýar. 2a suratda görkezilişi ýaly, mannitolsyz liofilizlenen insulin nanopartikullary üçin, skanerleýji elektron mikroskopiýasynda (SEM) uly, düzgünsiz we gödek ýüzli ýokary gözenekli poroşok gurluşy syn edildi. Suwsuzlandyrmadan soň poroşokda az sanly aýry bölejikler anyklandy (2e surat). Bu netijeler köp NP-leriň hiç hili krioprotektorsyz doňdurylyp guradylan wagtynda parçalanandygyny görkezdi. 1% mannitol saklaýan doňdurylyp guradylan we püskürtülip guradylan insulin nanopartikullary üçin tekiz ýüzli sferiki nanopartikullar syn edildi (Şekil 1). 2b,d,f,h). Mannitolsyz püskürtme bilen guradylan insulin nanopartikullary sferik görnüşde galdy, ýöne ýüzünde gyrymsy galdy (2c-nji surat). Sferik we gyrymsy ýüzler aşakda bölünip çykma häsiýetinde we öýjük siňdiriş synaglarynda has giňişleýin ara alnyp maslahatlaşylýar. Guradylan NP-leriň görünýän görnüşine esaslanyp, mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-ler hem, mannitol bilen doňdurylyp we püskürtme bilen guradylan NP-ler hem inçe NP poroşoklaryny berdi (2f,g,h-nji surat). Bölejikleriň ýüzleriniň arasyndaky ýüz meýdany näçe uly bolsa, ereýänligi şonça ýokary we şonuň üçin bölünip çykma tizligi hem şonça ýokary bolýar.
Dürli guradylan insulin NP-leriniň morfologiýasy: (a) Mannitolsyz liofilizirlenen insulin NP-leriniň SEM şekili; (b) Mannitolly liofilizirlenen insulin NP-leriniň SEM şekili; (c) Mannitolsyz püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň SEM şekili; (d) Mannitol bilen püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň SEM şekili; (e) Mannitolsyz liofilizirlenen insulin NP-leriniň poroşogynyň şekili; (f) Mannitolly liofilizirlenen insulin NP-leriniň şekili; (g) Mannitolsyz püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň poroşogynyň şekili; (h) Mannitolly püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň poroşogynyň şekili.
Doňduryp guradylanda, mannitol krioprotektor hökmünde hereket edýär, NP-leri amorf görnüşde saklaýar we buz kristallarynyň zeperlenmeginiň öňüni alýar19. Tersine, püskürtme guradylanda doňdurma tapgyry ýok. Şonuň üçin bu usulda mannitol gerek däl. Aslynda, mannitolsyz püskürtme guradylan NP-ler öň beýan edilişi ýaly has inçe NP-leri berdi. Şeýle-de bolsa, mannitol püskürtme guradylanda doldurgyç hökmünde hereket edip, NP-lere has sferik gurluş berýär20 (2d surat), bu bolsa şeýle kapsulalanan NP-leriň birmeňzeş bölünip çykma häsiýetini gazanmaga kömek edýär. Mundan başga-da, käbir uly bölejikleriň mannitol saklaýan doňduryp guradylan we püskürtme guradylan insulin NP-lerinde hem ýüze çykarylyp bilinýändigi aýdyňdyr (2b, d surat), bu bolsa mannitolyň bölejik ýadrosynda kapsulalanan insulin bilen bilelikde toplanmagy bilen baglanyşykly bolup biler. Hitozan gatlagyna. Bu gözlegde, suwsuzlandyrmadan soň sferiki gurluşyň bitewi galmagyny üpjün etmek üçin, mannitol we hitozanyň gatnaşygynyň 5:1 derejesinde saklanýandygyny bellemek gerek, şonuň üçin köp mukdarda doldurgyç guradylan NP-leriň bölejikleriniň ululygyny hem ulaldyp biler.
Furýe transform infragyzyl gowşadylan umumy şöhlelenme (FTIR-ATR) spektroskopiýasy erkin insuliniň, hitosan, hitosan, TPP we insuliniň fiziki garyndysyny häsiýetlendirdi. Guradylan NP-leriň hemmesi FTIR-ATR spektroskopiýasy arkaly häsiýetlendirildi. Esasan hem, mannitol bilen doňdurylyp guradylan kapsulalanan NP-lerde we mannitol bilen we mannitolsyz püskürtülip guradylan NP-lerde 1641, 1543 we 1412 sm-1 zolak intensiwlikleri syn edildi (3-nji surat). Öň habar berlişi ýaly, güýjüň bu artmagy hitosan, TPP we insuliniň arasyndaky özara baglanyşyk bilen baglanyşyklydy. Hitosan bilen insuliniň arasyndaky özara täsiriň derňelmegi, insulin ýüklenen hitosan nanopartikullarynyň FTIR spektrlerinde hitosan zolagynyň insuliniň zolagy bilen gabat gelýändigini we karbonil intensiwligini (1641 sm-1) we amin (1543 sm-1) zolagyny artdyrýandygyny görkezdi. TPP-niň tripolifosfat toparlary hitosandaky ammonium toparlary bilen baglanyşyklydyr, 1412 sm-1 ululykda zolak emele getirýär.
Dürli usullar bilen guradylan erkin insuliniň, hitosan, hitosan/TPP/insuliniň fiziki garyndylarynyň we NP-leriň FTIR-ATR spektrleri.
Mundan başga-da, bu netijeler SEM-de görkezilen netijeler bilen gabat gelýär, olar kapsulalanan NP-leriň mannitol bilen püskürilende we doňdurylyp guradylanda hem bitewi galandygyny, ýöne mannitol bolmadyk ýagdaýynda diňe püskürilip guradylanda kapsulalanan bölejikleri öndürýändigini görkezdi. Tersine, mannitolsyz doňdurylyp guradylan NP-leriň FTIR-ATR spektral netijeleri hitosan, TPP we insuliniň fiziki garyndysyna örän meňzeşdi. Bu netije hitosan, TPP we insuliniň arasyndaky özara baglanyşyklaryň mannitolsyz doňdurylyp guradylan NP-lerde indi ýokdugyny görkezýär. NP-leriň gurluşy krioprotektorsyz doňdurylyp guradylanda ýok edildi, muny SEM netijelerinde görmek bolýar (2a-njy surat). Guradylan insulin NP-leriniň morfologiýasyna we FTIR netijelerine esaslanyp, diňe liofilizlenen, püskürilip guradylan we mannitolsyz NP-ler gaýtadan dikeltmek tejribeleri we mannitolsyz NP-ler üçin ulanyldy, sebäbi mannitolsyz NP-leriň parçalanmagy sebäpli... suwsuzlanma. ara alyp maslahatlaşyň.
Suwsuzlandyrma uzak möhletli saklamak we başga formulalara gaýtadan işlemek üçin ulanylýar. Gury NP-leriň saklanandan soň gaýtadan döremek ukyby, olaryň tabletkalar we plýonkalar ýaly dürli formulalarda ulanylmagy üçin örän möhümdir. Mannitol ýoklugynda püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň ortaça bölejikleriniň ölçeginiň gaýtadan dikeldilenden soň diňe birneme artandygyny gördük. Beýleki tarapdan, püskürtme bilen guradylan we doňdurma bilen guradylan insulin nanopartikullarynyň bölejikleriniň ölçegi mannitol bilen ep-esli artdy (1-nji tablisa). Bu gözlegde ähli NP-leriň rekombinasiýasyndan soň PDI we EE düýpli üýtgemedi (p > 0,05) (1-nji tablisa). Bu netije bölejikleriň köpüsiniň gaýtadan ereýänden soň hem bitewi galandygyny görkezýär. Şeýle-de bolsa, mannitolyň goşulmagy liofilleşdirilen we püskürtme bilen guradylan mannitol nanopartikullarynyň insulin ýüklenmesini ep-esli azaltdy (1-nji tablisa). Tersine, mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-leriň insulin ýüklenme mukdary öňküsi ýaly galdy (1-nji tablisa).
Nanopartikullaryň ýüklenmeginiň derman serişdelerini ibermek üçin ulanylanda örän möhümdigi mälim. Pes ýüklenýän NP-ler üçin terapewtiki derejä ýetmek üçin örän köp mukdarda material gerek bolýar. Şeýle-de bolsa, şeýle ýokary NP konsentrasiýalarynyň ýokary ýapyşyklygy degişlilikde agyz arkaly kabul etmekde we inýeksiýa formulalarynda kynçylyga we kynçylyklara getirýär 22. Mundan başga-da, insulin NP-leri tabletkalary we ýapyşykly bioplenkalary 23, 24 ýasamak üçin hem ulanylyp bilner, bu bolsa pes ýüklenýän derejede köp mukdarda NP-leriň ulanylmagyny talap edýär, netijede agyz arkaly ulanmak üçin amatly bolmadyk uly tabletkalar we galyň bioplenkalar emele gelýär. Şonuň üçin, ýokary insulin ýüki bolan guradylan NP-ler örän isleg bildirilýändir. Netijelerimiz mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-leriň ýokary insulin ýüküniň bu alternatiw eltip bermek usullary üçin köp sanly özüne çekiji artykmaçlyklary hödürläp biljekdigini görkezýär.
Guradylan NP-leriň hemmesi üç aýlap sowadyjyda saklandy. SEM netijeleri üç aýlyk saklanyş döwründe ähli guradylan NP-leriň morfologiýasynyň düýpli üýtgemedigini görkezdi (4-nji surat). Suwda dikeldilenden soň, ähli NP-ler EE-niň birneme azalandygyny görkezdi we üç aýlyk saklanyş döwründe insuliniň takmynan az mukdaryny (~5%) çykardy (2-nji tablisa). Şeýle-de bolsa, ähli nanopartikullaryň ortaça bölejik ölçegleri artdy. Mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-leriň bölejik ölçegleri 525 nm-e çenli, mannitol bilen püskürtme bilen guradylan we doňduryp guradylan NP-leriň bolsa bölejik ölçegleri degişlilikde 872 we 921 nm-e çenli artdy (2-nji tablisa).
Üç aýlap saklanan dürli guradylan insulin NP-leriniň morfologiýasy: (a) Mannitol goşulan liofilizlenen insulin NP-leriniň SEM şekili; (b) Mannitol goşulmadyk püskürtme bilen guradylan insulin nanopartikullarynyň SEM şekili; (c) mannitol goşulmadyk püskürtme bilen guradylan insulin NP-leriniň SEM şekilleri.
Mundan başga-da, mannitol bilen püskürtme arkaly guradylan we doňdurma arkaly guradylan gaýtadan döredilen insulin nanopartikullarynda çökündiler görüldi (S2-nji surat). Bu uly bölejikleriň suwda dogry saklanmazlygy sebäpli bolup biler. Ýokardaky ähli netijeler püskürtme arkaly guradyş usulynyň insulin nanopartikullaryny suwsuzlanmadan gorap biljekdigini we insulin nanopartikullarynyň ýokary möçberde bolmagyny doldurgyçlar ýa-da krioprotektorlar bolmazdan alyp boljakdygyny görkezýär.
Insuliniň saklanmagy, suwsuzlandyrylandan soň fermentatiw siňdirişden gorag ukybyny görkezmek üçin pH = 2.5 gurşawda pepsin, tripsin we α-himotripsin bilen synagdan geçirildi. Suwsuzlandyrylan NP-leriň insuliniň saklanmagy täze taýýarlanan NP-leriňki bilen deňeşdirildi we erkin insulin negatiw gözegçilik hökmünde ulanyldy. Bu gözlegde erkin insulin üç fermentatiw bejerginiň hemmesinde 4 sagadyň dowamynda insuliniň çalt aýrylmagyny görkezdi (5a-c surat). Tersine, mannitol bilen doňdurylyp guradylan NP-leriň we mannitol bilen ýa-da mannitolsyz püskürtülip guradylan NP-leriň insuliniň aýrylmagy boýunça synag bu NP-leriň fermentatiw siňdirişden has ýokary goragyny görkezdi, bu bolsa täze taýýarlanan insulin NP-lerine meňzeşdi (1-nji surat). 5a-c). Pepsin, tripsin we α-himotripsindäki nanopartikullaryň kömegi bilen insuliniň degişlilikde 50%, 60% we 75% -den gowragy 4 sagadyň dowamynda goralyp bilnerdi (5a-c surat). Bu insulini goraýjy ukyby gan akymyna insuliniň has ýokary derejede siňdirilme mümkinçiligini artdyryp biler25. Bu netijeler mannitol bilen ýa-da mannitolsyz sprey guradyşyň we mannitol bilen doňduryp guradyşyň suwsuzlanmadan soň NP-leriň insulin gorag ukybyny saklap biljekdigini görkezýär.
Guradylan insulin NP-leriniň goragy we bölünip çykmagy: (a) pepsin ergininde insuliniň goragy; (b) tripsin ergininde insuliniň goragy; (c) α-himotripsin ergini bilen insuliniň goragy; (d) pH = 2.5 ergininde guradylan NP-leriň bölünip çykmagy; (e) pH = 6.6 ergininde guradylan NP-leriň bölünip çykmagy; (f) pH = 7.0 ergininde guradylan NP-leriň bölünip çykmagy.
Täze taýýarlanan we dikeldilen gurak insulin NP-leri insuliniň insulin garşylygyna täsirini öwrenmek üçin aşgazanyň, on iki barmak içegäniň we ýokarky inçe içegäniň pH gurşawyny modelleşdirmek arkaly 37 °C-de dürli buferlerde (pH = 2.5, 6.6, 7.0) inkubasiýa edildi. Dürli gurşawda bölünip çykma häsiýeti. Aşgazan-içege ulgamynyň bölegi. pH = 2.5 bolanda, insulin ýüklenen NP-ler we gaýtadan ereýän gurak insulin NP-leri ilkinji bir sagadyň dowamynda ilkinji gezek bölünip çykmany görkezdi, soňra bolsa indiki 5 sagadyň dowamynda haýal boşadyldy (5d surat). Başlangyçdaky bu çalt boşadylma, ähtimal, bölejigiň içki gurluşynda doly hereketsiz bolmadyk belok molekulalarynyň çalt ýüzleý desorbsiýasynyň netijesidir. pH = 6.5 bolanda, insulin ýüklenen NP-ler we gaýtadan döredilen gurak insulin NP-leri synag ergininiň pH-y NP-ler tarapyndan taýýarlanan ergininiň pH-yna meňzeş bolany üçin 6 sagadyň dowamynda ýumşak we haýal boşadyldy (5e surat). pH = 7 bolanda, NP-ler durnuksyzdy we ilkinji iki sagadyň dowamynda diýen ýaly doly dargady (5f surat). Sebäbi hitozanyň deprotonlaşmasy ýokary pH-da bolýar, bu bolsa has az ykjam polimer toruna we ýüklenen insuliniň boşadylmagyna getirýär.
Mundan başga-da, mannitolsyz püskürtme bilen guradylan insulin NP-leri beýleki guradylan NP-lere garanyňda has çalt bölünip çykma profilini görkezdi (5d–f surat). Öň beýan edilişi ýaly, mannitolsyz guradylan dikeldilen insulin NP-leri iň kiçi bölejik ölçegini görkezdi. Kiçi bölejikler has uly ýüz meýdanyny üpjün edýär, şonuň üçin degişli dermanyň köpüsi bölejikleriň ýüzünde ýa-da golaýynda bolar, bu bolsa dermanyň çalt bölünip çykmagyna getirýär26.
NP-leriň sitotoksikligi MTT synagy arkaly öwrenildi. S4-nji suratda görkezilişi ýaly, ähli guradylan NP-leriň 50–500 μg/ml konsentrasiýalarynda öýjükleriň ýaşaýyş ukybyna düýpli täsir etmeýändigi anyklandy, bu bolsa ähli guradylan NP-leriň terapewtiki derejä ýetmek üçin howpsuz ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
Bagyr insuliniň fiziologiki funksiýalaryny ýerine ýetirýän esasy organdyr. HepG2 öýjükleri, in vitro gepatositleriň özleşdiriş modeli hökmünde giňden ulanylýan adam gepatoma öýjük liniýasydyr. Bu ýerde HepG2 öýjükleri doňduryp guratmak we püskürtmek arkaly guradylan NP-leriň öýjük özleşdirilişini bahalandyrmak üçin ulanyldy. Akym sitometriýasy we 25 μg/ml konsentrasiýasynda erkin FITC insulin bilen birnäçe sagat inkubasiýadan soň görme arkaly konfokal lazer skanirleme arkaly öýjük özleşdirilişi, täze taýýarlanan FITC insulin ýüklenen NP-ler we deň insulin konsentrasiýalarynda guradylan FITC insulin ýüklenen NP-ler. Mukdar mikroskopiýasy (CLSM) gözegçilikleri geçirildi. Mannitolsyz liofilizirlenen NP-ler suwsuzlandyrylan wagtynda ýok edildi we bu synagda baha berilmedi. Täze taýýarlanan insulin ýüklenen NP-leriň, mannitolly liofilizirlenen NP-leriň we mannitolly we mannitolsyz püskürtmek arkaly guradylan NP-leriň (6a-njy surat) öýjük içi fluoresensiýa intensiwlikleri 4.3 boldy, erkin insulinlerden 2.6, 2.4 we 4.1 esse ýokary. degişlilikde FITC-insulin topary (6b-nji surat). Bu netijeler, esasan, gözlegde öndürilen insulin ýüklenen nanopartikullaryň kiçi ölçegleri sebäpli, kapsulalanan insuliniň öýjükleriň özleşdirilmeginde erkin insuline garanyňda has güýçlidigini görkezýär.
Täze taýýarlanan NP-ler we guradylan NP-ler bilen 4 sagat inkubasiýadan soň HepG2 öýjükleriniň özleşdirilmegi: (a) HepG2 öýjükleri tarapyndan FITC-insuliniň özleşdirilmeginiň paýlanyşy.(b) Akym sitometriýasy arkaly seljerilen fluoresensiýa intensiwliginiň geometrik ortaça bahasy (n = 3), erkin insulin bilen deňeşdirilende *P < 0.05.
Şeýle hem, CLSM suratlary täze taýýarlanan FITC-insulin ýüklenen NP-leriň we FITC-insulin ýüklenen püskürtme bilen guradylan NP-leriň (mannitolsyz) FITC fluoresensiýa intensiwliginiň beýleki nusgalardakydan has güýçlidigini görkezdi (6a-njy surat). Mundan başga-da, mannitol goşulanda, erginiň ýokary ýapyşyklygy öýjükleriň özleşdirilmegine garşylygy artdyrdy we insuliniň köpelmeginiň azalmagyna getirdi. Bu netijeler mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-leriň öýjükleriň özleşdirilmeginiň iň ýokary netijeliligini görkezýändigini görkezýär, sebäbi olaryň bölejikleriniň ölçegi gaýtadan ereýänden soň doňdurylan gury NP-lerden kiçi boldy.
Hitosan (ortaça molekulýar agramy 100 KDa, 75–85% deasetillenen) Sigma-Aldrich-den satyn alyndy. (Oakville, Ontario, Kanada). Natriý tripolifosfaty (TPP) VWR-den (Radnor, Pensilwaniýa, ABŞ) satyn alyndy. Bu gözlegde ulanylan rekombinant adam insulini Fisher Scientific-den (Waltham, MA, ABŞ) alyndy. Fluoresein izotiosiyanat (FITC) bilen belgilenen adam insulini we 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidrohloridi (DAPI) Sigma-Aldrich-den satyn alyndy. (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2 öýjük liniýasy ATCC-den (Manassas, Wirjiniýa, ABŞ) alyndy. Beýleki ähli reagentler analitik ýa-da hromatografik derejelerdedi.
1 mg/ml CS erginini 0,1% sirke turşusyny öz içine alýan iki gezek distille edilen suwda (DD suwunda) eretmek arkaly taýýarlaň. 1 mg/ml TPP we insulin erginlerini degişlilikde DD suwunda we 0,1% sirke turşusynda eretmek arkaly taýýarlaň. Öňünden emulsiýa politron PCU-2-110 ýokary tizlikli gomogenizator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ABŞ) bilen taýýarlanyldy. Taýýarlamak prosesi aşakdaky ýaly: ilki bilen 4 ml insulin erginine 2 ml TPP ergini goşulýar we garyndy 30 minutlap garyşdyrylýar we doly garyşdyrylýar. Soňra garyndy ergin şpris arkaly CS erginine damjalap goşulýar, ýokary tizlikli garyşdyrma (10,000 aý/min) astynda. Garyndylar buzly wannada 30 minutlap ýokary tizlikli garyşdyrma (15,000 aý/min) astynda saklandy we özara baglanyşykly insulin NP-lerini almak üçin belli bir pH derejesine sazlandy. Insulin NP-leriniň bölejikleriniň ululygyny has-da gomogenleşdirmek we azaltmak üçin, olar... zond görnüşli ultrasonikator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germaniýa) ulanyp, buzly wannada goşmaça 30 minutlap ultrasonik usulda işledildi.
Insulin NPS-leri 25°C-de DD suwunda eredilip, Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Awstriýa) ulanyp, dinamiki ýagtylyk saçylma (DLS) ölçeglerini ulanyp, Z-ortaça diametri, polidisperslik indeksi (PDI) we zeta potensialy üçin synagdan geçirildi. Morfologiýa we ölçeg paýlanyşy Hitachi H7600 geçiriji elektron mikroskopy (TEM) (Hitachi, Tokio, Ýaponiýa) arkaly häsiýetlendirildi we soňra suratlar Hitachi suratlandyryş programma üpjünçiligi (Hitachi, Tokio, Ýaponiýa) arkaly seljerildi. Insulin NP-leriniň kapsulalaşdyryş netijeliligini (EE) we ýükleme ukybyny (LC) bahalandyrmak üçin NP-ler molekulýar agramy 100 kDa bolan ultrafiltrasiýa turbalaryna pipetlendi we 30 minutlap 500 xg-de santrifuga edildi. Filtratdaky kapsulalaşdyrylmadyk insulin dörtlük nasosdan ybarat bolan Agilent 1100 seriýaly HPLC ulgamy (Agilent, Santa Klara, Kaliforniýa, ABŞ) arkaly sanlandy. awtosampler, sütun gyzdyryjy we DAD detektory. Insulin C18 sütuny (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, ABŞ) arkaly seljerildi we 214 nm-de anyklandy. Hereket edýän faza asetonitril we suwdan ybarat bolup, 0.1% TFA saklady, gradient gatnaşyklary 10/90-dan 100/0-a çenli boldy we 10 minut işledi. Hereket edýän faza 1.0 ml/min akym tizliginde pompalandy. Sütüniň temperaturasy 20 °C-e goýuldy. (1) we (2) deňlemelerini ulanyp, EE we LC-niň göterimlerini hasaplaň.
Insulin NP-ni optimizirlemek üçin 2.0-dan 4.0-a çenli dürli CS/insulin gatnaşyklary synagdan geçirildi. Taýýarlamak wagtynda dürli mukdarda CS ergini goşuldy, insulin/TPP garyndysy bolsa üýtgewsiz saklandy. Ähli erginleri (insulin, TPP we CS) goşandan soň garyndynyň pH-ny üns bilen gözegçilikde saklamak arkaly insulin NP-leri 4.0-dan 6.5-e çenli pH aralygynda taýýarlanyldy. Insulin NP-leriniň emele gelmegini optimizirlemek üçin insulin nanopartikullarynyň EE we bölejik ölçegleri dürli pH gymmatlyklarynda we CS/insulin massa gatnaşyklarynda bahalandyryldy.
Optimallaşdyrylan insulin NP-leri alýumin gapda ýerleşdirilip, käbir lenta bilen berklenen dokuma bilen örtüldi. Soňra, wintli gaplar tagta guradyjysy bilen enjamlaşdyrylan Labconco FreeZone doňduryjy guratgyçda (Labconco, Kanzas-Siti, MO, ABŞ) ýerleşdirildi. Gury insulin NP-lerini almak üçin temperatura we wakuum basyşy -10 °C, ilkinji 2 sagat üçin 0,350 Torr, 24 sagadyň galan 22 sagady üçin bolsa 0 °C we 0,120 Torr derejesinde bellenildi.
Kapsulalanan insulin öndürmek üçin Buchi Mini Spray Dryder B-290 (BÜCHI, Flawil, Şweýsariýa) ulanyldy. Saýlanan guradyş parametrleri: temperatura 100 °C, iýmit akymy 3 L/min we gaz akymy 4 L/min boldy.
Suwsuzlanmadan öň we soň insulin NP-leri FTIR-ATR spektroskopiýasy arkaly häsiýetlendirildi. Suwsuzlanan nanopartikullar, şeýle hem erkin insulin we hitozan uniwersal ATR nusga alyş aksesuary (PerkinElmer, Waltham, Massaçusets, ABŞ) bilen enjamlaşdyrylan Spectrum 100 FTIR spektrofotometri (PerkinElmer, Waltham, Massaçusets, ABŞ) arkaly seljerildi. Signalyň ortaça görkezijileri 4000-600 sm2 ýygylyk diapazonynda 4 sm2 çözgütde 16 skanirlemeden alyndy.
Gury insulin NP-leriniň morfologiýasy Helios NanoLab 650 Fokuslanan Ion Şöhle Skanirleýji Elektron Mikroskopy (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, ABŞ) tarapyndan düşürilen doňdurylyp guradylan we püskürtülip guradylan insulin NP-leriniň SEM suratlary arkaly bahalandyryldy. Ulanylan esasy parametr 5 keV naprýaženiýe we 30 mA tok boldy.
Suwsuzlaşdyrylan ähli insulin NP-leri dd suwunda gaýtadan eredi. Bölejikleriň ululygy, PDI, EE we LC suwsuzlandyrylandan soň hilini bahalandyrmak üçin öň agzalan şol bir usuly ulanyp gaýtadan synagdan geçirildi. Angidroinsulin NP-leriniň durnuklylygy hem uzak wagtlap saklanandan soň NP-leriň häsiýetlerini synagdan geçirmek arkaly ölçeldi. Bu gözlegde suwsuzlandyrylandan soň ähli NP-ler sowadyjyda üç aý saklandy. Üç aý saklanandan soň, NP-ler morfologiki bölejikleriň ululygy, PDI, EE we LC üçin synagdan geçirildi.
Insuliniň suwsuzlanmadan soň NP-leri goramakdaky netijeliligini bahalandyrmak üçin, 5 ml gaýtadan dikeldilen NP-leri simulýasiýa edilen aşgazan suwuklygyndan (pH 1.2, 1% pepsin saklaýar), içege suwuklygyndan (pH 6.8, 1% tripsin saklaýar) ýa-da himotripsin ergininden (100 g/ml, fosfat buferinde, pH 7.8) ybarat bolan 45 ml-de erediň. Olar 37°C-de 100 aýlaw/minut tizlikde garyşdyryldy. Dürli wagt nokatlarynda 500 μL ergin ýygnaldy we insuliniň konsentrasiýasy HPLC arkaly kesgitlenildi.
Täze taýýarlanan we guradylan insulin NP-leriniň in vitro bölünip çykma häsiýeti dializ haltasy usuly bilen synagdan geçirildi (molekulýar agramyň kesiş derejesi 100 kDa, Spectra Por Inc.). Täze taýýarlanan we dikeldilen gurak NP-ler aşgazanyň, on iki barmak içegäniň we ýokarky inçe içegäniň pH gurşawyny simulýasiýa etmek üçin degişlilikde pH 2.5, pH 6.6 we pH 7.0 (0.1 M fosfat-buferlenen duzly ergin, PBS) suwuklyklarda dializ edildi. Ähli nusgalar 200 aýlaw/minutda üznüksiz çaýkamak bilen 37 °C-de inkubasiýa edildi. 5 ml dializ haltasynyň daşyndaky suwuklygy aşakdaky wagtlarda soruň: 0.5, 1, 2, 3, 4 we 6 sagat we derrew göwrümi täze dializat bilen dolduryň. Suwuklykdaky insuliniň hapalanmagy HPLC arkaly seljerildi we nanopartikullardan insuliniň bölünip çykma tizligi bölünip çykan erkin insuliniň nanopartikullarda kapsulalanan umumy insuline gatnaşygyndan hasaplandy. (3-nji deňleme).
Adamyň gepatosellüler karsinomasynyň öýjük liniýasy HepG2 öýjükleri 10% fetal sygyr syworotkasyny, 100 IU/ml penisilini we 100 μg/ml streptomisini öz içine alýan Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ulanyp, 60 mm diametrli gaplarda ösdürilip ýetişdirildi29. Kulturalar 37°C, 95% otnositel çyglylykda we 5% CO2-de saklandy. Siňdiriş synaglary üçin HepG2 öýjükleri 1 × 105 öýjük/ml-de 8 guýulyk Nunc Lab-Tek kameraly slaýd ulgamyna (Thermo Fisher, NY, ABŞ) ekildi. Sitotoksiklik synaglary üçin olar 5 × 104 öýjük/ml dykyzlygynda 96 guýulykly plastinkalara (Corning, NY, ABŞ) ekildi.
MTT synagy täze taýýarlanan we guradylan insulin NPs30-yň sitotoksikligini bahalandyrmak üçin ulanyldy. HepG2 öýjükleri 96 guýulyk plastinkalara 5 × 104 öýjük/ml dykyzlygynda ekildi we synagdan 7 gün öň ösdürilip ýetişdirildi. Insulin NPs ösdürilip ýetişdirilýän gurşawda dürli konsentrasiýalara (50-den 500 μg/ml-e çenli) çenli suwlandyryldy we soňra öýjüklere berildi. 24 sagat inkubasiýadan soň, öýjükler PBS bilen 3 gezek ýuwuldy we goşmaça 4 sagatlap 0,5 mg/ml MTT saklaýan gurşaw bilen inkubasiýa edildi. Sitotoksiklik Tecan infinite M200 pro spektrofotometr plastinka okaýjysyny (Tecan, Männedorf, Şweýsariýa) ulanyp, sary tetrazolium MTT-niň 570 nm-de gyrmyzy formazana fermentatiw reduksiýasyny ölçemek arkaly bahalandyryldy.
NP-leriň öýjük siňdiriş netijeliligi konfokal lazer skanerleme mikroskopiýasy we akym sitometriýa analizi arkaly synagdan geçirildi. Nunc Lab-Tek kameraly slaýd ulgamynyň her bir guýusy erkin FITC-insulin, FITC-insulin ýüklenen NP-ler bilen işlenildi we şol bir konsentrasiýada 25 μg/ml guradylan FITC-insulin NP-leri gaýtadan döredildi we 4 sagatlap inkubasiýa edildi. Öýjükler PBS bilen 3 gezek ýuwuldy we 4% paraformaldegid bilen berkidildi. Ýadrolar 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) bilen boýaldy. Insuliniň ýerleşişi Olympus FV1000 lazer skanerleme/iki fotonly konfokal mikroskop (Olympus, Şinjuku şäheri, Tokio, Ýaponiýa) arkaly syn edildi. Akym sitometriýa analizi üçin 10 μg/ml erkin FITC-insulin, FITC-insulin ýüklenen NP-leriň we gaýtadan ereýän guradylan FITC-insulin NP-leri HepG2 öýjükleri bilen ekilen 96 guýulyk plastinkalara goşuldy we 4 sagatlap inkubasiýa edildi. 4 sagat inkubasiýadan soň, öýjükler aýryldy we FBS bilen 3 gezek ýuwuldy. Her nusga üçin 5 × 104 öýjük BD LSR II akym sitometri (BD, Franklin Lakes, Nýu-Jersi, Birleşen Ştatlar) arkaly seljerildi.
Ähli gymmatlyklar ortaça ± standart çykgyt hökmünde görkezilýär. Ähli toparlaryň arasyndaky deňeşdirmeler IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Nýu-Ýork, ABŞ) tarapyndan birtaraplaýyn ANOVA ýa-da t-test arkaly bahalandyryldy we p < 0.05 statistik taýdan ähmiýetli hasaplandy.
Bu gözleg, sprey guradyşynyň çeýeligini we özara baglanyşykly hitosan/TPP/insulin nanopartikullaryny suwsuzlandyrmak ukybyny görkezýär, bu bolsa göwrümleşdiriji agentleri ýa-da krioprotektorlary ulanýan standart doňduryp guratmak usullary bilen deňeşdirilende has gowy gaýtadan dikeldilmegi bilen tapawutlanýar. Optimallaşdyrylan insulin nanopartikullary ortaça 318 nm bölejik ululygyny we 99,4% kapsulalaşdyrma netijeliligini berdi. Suwsuzlandyryşdan soňky SEM we FTIR netijeleri sferiki gurluşyň diňe mannitolly we mannitolsyz we mannitolsyz sprey guradylan NP-lerde saklanýandygyny, ýöne mannitolsyz liofilizlenen NP-leriň suwsuzlandyryş wagtynda parçalanandygyny görkezdi. Dikeldiş ukyby synagynda, mannitolsyz sprey guradylan insulin nanopartikullary iň kiçi ortaça bölejik ululygyny we gaýtadan dikeldilende iň ýokary ýüklenmesini görkezdi. Bu suwsuzlandyrylan NP-leriň hemmesiniň bölünip çykmagy, olaryň pH = 2,5 we pH = 7 erginlerinde çalt bölünip çykarylýandygyny we pH = 6,5 ergininde örän durnuklydygyny görkezdi. Beýleki gaýtadan ereýänler bilen deňeşdirilende Suwsuzlaşdyrylan NP-lerde, mannitolsyz püskürtme bilen guradylan NP-ler iň çalt bölünip çykmagy görkezdi. Bu netije öýjük siňdiriş synagynda syn edilen netije bilen gabat gelýär, sebäbi mannitol ýoklugynda püskürtme bilen guradylan NP-ler täze taýýarlanan NP-leriň öýjük siňdiriş netijeliligini diýen ýaly doly saklady. Bu netijeler mannitolsyz püskürtme bilen guradylan gurak insulin nanopartikullarynyň agyz tabletkalary ýa-da bioýelim plýonkalar ýaly beýleki suwsuz doza görnüşlerine gaýtadan işlemek üçin iň amatlydygyny görkezýär.
Intellektual eýeçilik meseleleri sebäpli, häzirki gözlegiň dowamynda döredilen we/ýa-da seljerilen maglumatlar toplumy köpçülige elýeterli däl, ýöne degişli awtorlardan zerur talaplar boýunça elýeterlidir.
Kagan, A. 2-nji görnüşli diabet: sosial we ylmy gelip çykyşlar, lukmançylyk kynçylyklary we hassalar we beýlekiler üçin netijeleri. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. we Jiang, P. Insulin kapsulasiýasynyň işlenip düzülmegi: indi agyz arkaly kabul etmek mümkinmi? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. we Dass, CR Diabet keselini bejermek üçin agyz arkaly insulin ýüklenen liposoma eltme ulgamlarynda soňky ösüşler. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).