Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS goldawy çäkli. Iň gowy netijeler üçin brauzeriňiziň täze wersiýasyny ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stilizasiýasyz ýa-da JavaScript-siz görkezýäris.
Propion turşusy (PPA) awtizm spektr bozulmasy ýaly newroösüş bozulmalarynda mitohondrial disfunksiýanyň roluny öwrenmek üçin ulanylýar. PPA-nyň mitohondrial biogenezi, metabolizm we aýlanyşy bozýandygy mälim. Şeýle-de bolsa, PPA-nyň mitohondrial dinamika, bölünme we birleşme täsiri bu mehanizmleriň çylşyrymly wagt häsiýeti sebäpli problemaly bolmagynda galýar. Bu ýerde biz PPA-nyň neýron ýaly SH-SY5Y öýjüklerinde mitohondrial ultrastruktura, morfologiýa we dinamika nähili täsir edýändigini öwrenmek üçin goşmaça mukdary suratlandyryş usullaryny ulanýarys. PPA (5 mM) mitohondrial meýdanyň (p < 0.01), Feret diametriniň we aýlawynyň (p < 0.05) we 2-nji meýdanyň (p < 0.01) ep-esli azalmagyna sebäp boldy. Mitohondrial wakalaryň lokatorynyň seljermesi bölünme we birleşme wakalarynyň ep-esli artandygyny (p < 0.05) görkezdi, şeýlelik bilen stres şertlerinde mitohondrial ulgamyň bitewüligini saklady. Mundan başga-da, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) we OPA1 (p < 0.05) mRNA ekspresiýasy ep-esli azaldy. 01). Bu stres şertlerinde funksiýany saklamak üçin mitohondrial morfologiýanyň, biogeneziň we dinamikanyň täzeden gurulmagyny görkezýär. Maglumatlarymyz PPA-nyň mitohondrial dinamika täsirine täze düşünje berýär we mitohondrial stress jogaplaryna gatnaşýan çylşyrymly düzgünleşdiriji mehanizmleri öwrenmek üçin suratlandyryş usullarynyň peýdalydygyny nygtaýar.
Mitohondriýalar energiýa öndürmekdäki we biosintezdäki adaty rollaryndan başga-da dürli öýjük funksiýalarynyň aýrylmaz gatnaşyjylarydyr. Mitohondriýa metabolizmi kalsiý signallaşdyrmasynyň, metabolik we oksidlenme-oksudylma gomeostazynyň, iltihaplanma signallaşdyrmasynyň, epigenetiki üýtgeşmeleriň, öýjükleriň köpelmeginiň, tapawutlanmagynyň we programmalaşdyrylan öýjük ölüminiň esasy düzgünleşdirijisidir1. Hususan-da, mitohondriýa metabolizmi neýronlaryň ösüşi, ýaşamagy we işlemegi üçin örän möhümdir we neýropatologiýanyň dürli görnüşlerinde giňden ulanylýar2,3,4.
Soňky onýyllygyň dowamynda metabolik ýagdaý neýrogeneziň, differensiasiýanyň, ýetişmegiň we plastikligiň merkezi düzgünleşdirijisi hökmünde ýüze çykdy5,6. Soňky döwürde mitohondrial morfologiýa we dinamika mitozyň, ýagny öýjükleriň içinde sagdyn mitohondriýalaryň toplumyny saklaýan dinamiki prosesiň aýratyn möhüm böleklerine öwrüldi. Mitohondrial dinamika mitohondrial biogenezden we bioenergiýadan mitohondrial bölünme, birleşme, daşamak we arassalamak ýaly çylşyrymly özara bagly ýollar arkaly düzgünleşdirilýär7,8. Bu integrasiýa mehanizmleriniň haýsydyr biriniň bozulmagy sagdyn mitohondrial torlaryň saklanmagyna päsgel berýär we neýroösüş üçin çuňňur funksional netijeleri döredýär9,10. Hakykatdan-da, mitohondrial dinamikanyň bozulmagy köp sanly psihiki, neýrodegeneratiw we neýroösüş bozulmalarynda, şol sanda autizm spektr bozulmalarynda (ASD) syn edilýär11,12.
ASD çylşyrymly genetiki we epigenetiki arhitekturasy bolan dürli görnüşli newroösüş bozulmasydyr. ASD-niň mirasdüşerligi jedelsizdir, ýöne onuň esasy molekulýar etiologiýasy henizem gowy düşünilmedik. Klinikadan öňki modellerden, kliniki barlaglardan we köp omikaly molekulýar maglumatlar toplumyndan toplanan maglumatlar ASD13,14-de mitohondrial disfunksiýanyň barha köp subutnamasyny berýär. Biz ozal ASD-li näsaglaryň kohortasynda genom boýunça DNK metilleşme skriningini geçirdik we mitohondrial metabolik ýollar boýunça toparlanan dürli metilleşdirilen genleri anykladyk15. Soňra biz mitohondrial biogeneziň we dinamikanyň merkezi düzgünleşdirijileriniň dürli metilleşmesini habar berdik, bu bolsa ASD16-da mtDNK nusgalarynyň sanynyň artmagy we siýdik metabolik profiliniň üýtgemegi bilen baglanyşyklydy. Maglumatlarymyz mitohondrial dinamikanyň we gomeostazyň ASD-niň patofiziologiýasynda esasy rol oýnaýandygynyň barha köp subutnamasyny berýär. Şonuň üçin mitohondrial dinamikanyň, morfologiýanyň we funksiýanyň arasyndaky gatnaşygyň mehanistik düşünişini gowulandyrmak ikinji derejeli mitohondrial disfunksiýa bilen häsiýetlendirilýän newrologik keseller boýunça dowam edýän ylmy-barlaglaryň esasy maksadydyr.
Molekulýar usullar köplenç mitohondrial stress reaksiýalarynda belli bir genleriň roluny öwrenmek üçin ulanylýar. Şeýle-de bolsa, bu çemeleşme mitotik gözegçilik mehanizmleriniň köpugurly we wagt häsiýeti bilen çäklendirilip bilner. Mundan başga-da, mitohondrial genleriň differensial ekspresiýasy funksional üýtgeşmeleriň gytaklaýyn görkezijisidir, esasanam diňe çäkli sanly genler adatça seljerilýär. Şonuň üçin mitohondrial funksiýany we bioenergetikany öwrenmek üçin has gönümel usullar teklip edildi17. Mitohondrial morfologiýa mitohondrial dinamika bilen ýakyndan baglanyşyklydyr. Mitohondrial görnüşi, baglanyşygy we gurluşy energiýa öndürmek we mitohondrial we öýjükleriň ýaşamagy üçin möhümdir5,18. Mundan başga-da, mitozonyň dürli bölekleri mitohondrial morfologiýadaky üýtgeşmelere ünsi jemleýär, bu bolsa mitohondrial disfunksiýanyň peýdaly uç nokatlary bolup hyzmat edip biler we soňraky mehanistik barlaglar üçin esas bolup biler.
Mitohondrial morfologiýany göni geçiriş elektron mikroskopiýasy (TEM) arkaly synlap bolýar, bu bolsa öýjük ultrastrukturasyny jikme-jik öwrenmäge mümkinçilik berýär. TEM diňe öýjük populýasiýalarynda gen transkripsiýasyna, belok ekspresiýasyna ýa-da mitohondrial funksional parametrlere daýanmagyň ýerine, mitohondrial kristallaryň morfologiýasyny, görnüşini we gurluşyny aýratyn mitohondriallaryň çözgüdinde gönüden-göni wizuallaşdyrýar17,19,20. Mundan başga-da, TEM mitohondrial funksiýada we gomeostazda möhüm rol oýnaýan endoplazmatik retikulum we awtofagosomalar ýaly beýleki organellalar bilen özara täsirleri öwrenmäge ýardam edýär21,22. Şeýlelik bilen, bu TEM-i belli bir ýollara ýa-da genlere üns bermezden ozal mitohondrial disfunksiýany öwrenmek üçin gowy başlangyç nokadyna öwürýär. Mitohondrial funksiýa newropatologiýa üçin barha möhüm bolup başlanda, mitohondrial morfologiýany we dinamikasyny in vitro neýron modellerinde gönüden-göni we mukdary taýdan öwrenmäge mümkinçilik bermek zerurlygy ýüze çykýar.
Bu makalada biz autizm spektr bozulmasynda mitohondrial disfunksiýanyň neýron modelinde mitohondrial dinamikany öwrenýäris. Biz öň mitohondrial propionil-CoA karboksilaza fermenti PCC-niň kiçi birligi bolan ASD15-de propionil-CoA karboksilaza beta (PCCB)-niň differensial metilleşmesini habar berdik. PCC-niň bozulmagy propion turşusy (PPA)23,24,25 ýaly propionil türewleriniň zäherli toplanmagyna sebäp bolýandygy mälim. PPA-nyň in vivo neýron metabolizmini bozýandygy we özüni alyp barşy üýtgedýändigi görkezildi we ASD26,27,28-de gatnaşýan neýroösüş mehanizmlerini öwrenmek üçin döredilen haýwan modelidir. Mundan başga-da, PPA-nyň in vitro mitohondrial membran potensialyny, biogenezi we dem alyşyny bozýandygy habar berildi we neýronlarda mitohondrial disfunksiýany modelleşdirmek üçin giňden ulanyldy29,30. Şeýle-de bolsa, PPA-nyň sebäp bolan mitohondrial disfunksiýanyň mitohondrial morfologiýasyna we dinamikasyna täsiri henizem gowy düşünilmedik bolmagynda galýar.
Bu gözlegde SH-SY5Y öýjüklerinde PPA-nyň mitohondrial morfologiýasyna, dinamikasyna we funksiýasyna täsirini kesgitlemek üçin goşmaça suratlandyryş usullaryny ulanylýar. Ilki bilen, mitohondrial morfologiýadaky we ultrastrukturadaky üýtgeşmeleri görmek üçin TEM usulyny işläp düzdik17,31,32. Mitohondrialyň33 dinamiki tebigatyny göz öňünde tutup, bölünme we birleşme wakalarynyň arasyndaky deňagramlylygyň, mitohondrial sanynyň we PPA stresi astyndaky göwrümiň üýtgeşmelerini kesgitlemek üçin mitohondrial waka lokalizatoryny (MEL) analizini hem ulandyk. Ahyrsoňy, mitohondrial morfologiýanyň we dinamikanyň biogenez, bölünme we birleşme proseslerine gatnaşýan genleriň ekspresiýasyndaky üýtgeşmeler bilen baglanyşyklydygyny ýa-da baglanyşykly däldigini barladyk. Umumylykda, biziň maglumatlarymyz mitohondrial dinamikany düzgünleşdirýän mehanizmleriň çylşyrymlylygyny düşündirmegiň kynçylygyny görkezýär. Biz SH-SY5Y öýjüklerinde mitozyň ölçelip bilinýän konwergent uç nokady hökmünde mitohondrial morfologiýany öwrenmekde TEM-iň peýdasyny nygtaýarys. Mundan başga-da, biz TEM maglumatlarynyň metabolik strese jogap hökmünde dinamiki wakalary hem öz içine alýan suratlandyryş usullary bilen utgaşdyrylanda iň baý maglumatlary berýändigini nygtaýarys. Neýron öýjükleriniň mitozyny goldaýan molekulýar düzgünleşdiriji mehanizmleriň has giňişleýin häsiýetlendirilmegi nerw ulgamynyň we neýrodegeneratiw keselleriň mitohondrial bölegi barada möhüm düşünje berip biler.
Mitohondrial stresi döretmek üçin SH-SY5Y öýjükleri 3 mM we 5 mM natriý propionaty (NaP) ulanyp PPA bilen işlenildi. TEM-den öň, nusgalar ýokary basyşly doňdurma we doňdurma arkaly kriogen nusga taýýarlamasyna sezewar edildi (1a-njy surat). Üç biologik gaýtalama boýunça mitohondrial populýasiýalaryň sekiz morfologik parametrini ölçemek üçin awtomatlaşdyrylan mitohondrial surat seljeriş turba geçirijisini işläp düzdik. PPA bejergisiniň dört parametri düýpli üýtgedendigini anykladyk: 2-nji meýdan, meýdan, perimetr we Feret diametri (1b-e-nji surat). 2-nji meýdan 3 mM we 5 mM PPA bejergisi bilen düýpli azaldy (degişlilikde p = 0.0183 we p = 0.002) (1b-nji surat), meýdan (p = 0.003), perimetr (p = 0.0106) we Feret diametri düýpli azaldy. 5 mM bejergi toparynda gözegçilik topary bilen deňeşdirilende düýpli azalma (p = 0.0172) boldy (1c-e-nji surat). Meýdan we çemberiň ep-esli azalmagy, 5 mM PPA bilen bejerilen öýjükleriň has kiçi, has tegelek mitohondriýalara eýedigini we bu mitohondriýalaryň gözegçilik öýjüklerindäkilerden has az uzalyp galandygyny görkezdi. Bu, Feret diametriniň ep-esli azalmagy bilen hem gabat gelýär, bu bolsa bölejikleriň gyralarynyň arasyndaky iň uly aralygyň azalmagyny görkezýän garaşsyz parametrdir. Kristalaryň ultrastrukturyndaky üýtgeşmeler syn edildi: PPA stresiniň täsiri astynda kristalar has az duýuldy (1a surat, B paneli). Şeýle-de bolsa, ähli suratlar kristalaryň ultrastrukturyny aýdyň görkezmedi, şonuň üçin bu üýtgeşmeleriň mukdary seljermesi geçirilmedi. Bu TEM maglumatlary üç mümkin bolan senariýi görkezip biler: (1) PPA bölünmegi güýçlendirýär ýa-da birleşmegi bökdeýär, bar bolan mitohondriýalaryň ululygynyň kiçelmegine sebäp bolýar; (2) güýçlendirilen biogenez täze, has kiçi mitohondriýalary döredýär ýa-da (3) iki mehanizmi bir wagtda döredýär. Bu şertleri TEM bilen tapawutlandyryp bolmasa-da, ep-esli morfologiki üýtgeşmeler mitohondriýa gomeostazynda we PPA stresi astynda dinamikada üýtgeşmeleri görkezýär. Soňra biz bu dinamikalary we olaryň esasynda ýatan mümkin bolan mehanizmleri has-da häsiýetlendirmek üçin goşmaça parametrleri öwrendik.
Propion turşusy (PPA) mitohondrial morfologiýany täzeden düzýär. (a) PPA bejergisiniň artmagy bilen mitohondrial ölçegleriň kiçelýändigini we mitohondriallaryň has kiçi we tegelek bolýandygyny görkezýän wekilçilikli geçirijilik elektron mikroskopiýasynyň (TEM) suratlary; degişlilikde 0 mM (bejerilmedik), 3 mM we 5 mM. Gyzyl oklaryň mitohondriallary görkezýändigi aýdylýar. (b–e) 24 sagatlap PPA bilen bejerilen SH-SY5Y öýjükleri TEM üçin taýýarlanyldy we netijeler Fiji/ImageJ ulanyp seljerildi. Sekiz parametriň dördüsi gözegçilik (bejerilmedik, 0 mM PPA) we bejerilen (3 mM we 5 mM PPA) öýjükleriniň arasynda möhüm tapawutlary görkezdi. (b) 2-nji sebit, (c) Meýdan, (d) Perimetr, (e) Feret diametri. Mümkin tapawutlary kesgitlemek üçin birtaraplaýyn üýtgeşiklik seljermesi (gözegçilik we bejergi) we Dannettiň köptaraplaýyn deňeşdirme synagy ulanyldy (p < 0.05). Maglumat nokatlary her bir aýratyn öýjük üçin ortaça mitohondrial gymmaty görkezýär we ýalňyşlyk zolaklary ortaça ± SEM-i görkezýär. Görkezilen maglumatlar n = 3-i görkezýär, her gaýtalanmada azyndan 24 öýjük; jemi 266 surat seljerildi; * p < 0.05-i görkezýär, ** p < 0.01-i görkezýär.
Mitohondrial dinamikanyň PPA-a nähili jogap berýändigini has jikme-jik häsiýetlendirmek üçin, biz mitohondriallary tetrametilrodamin etil efiri (TMRE) bilen boýadyk we 3 we 5 mM PPA-da 24 sagatdan soň mitohondriallary lokallaşdyrmak we mukdaryny kesgitlemek üçin wagt aralygy mikroskopiýasyny we MEL analizini ulandyk. Bölünme we birleşme wakalaryny bejermek. (2a-njy surat). MEL analizinden soň, mitohondrial gurluşlaryň sanyny we olaryň ortaça göwrümini kesgitlemek üçin mitohondriallar has giňişleýin seljerildi. Biz bölünme [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)) we birleşme [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] we birleşme [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] hadysalary bilen deňeşdirilende 3 mM-de [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] bölünme wakalarynyň sanynyň kiçi, ýöne ep-esli artandygyny synladyk, bu bolsa gözegçilik toparyna garanyňda 5 mM-de ep-esli artdy (3b-nji surat). Mitohondriýalaryň sany 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] we 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)]-de ep-esli artdy (3c-nji surat), her bir mitohondrial gurluşyň ortaça göwrümi bolsa üýtgewsiz galdy (3c-nji surat). 3d). Umuman alanyňda, bu mitohondrial dinamikanyň täzeden gurulmagynyň mitohondrial toruň bitewüligini üstünlikli saklaýan kompensator jogap hökmünde hyzmat edýändigini görkezýär. 3 mM PPA-da bölünme wakalarynyň sanynyň artmagy mitohondrial sanynyň artmagynyň bölekleýin mitohondrial bölünme bilen baglanyşyklydygyny görkezýär, ýöne mitohondrialyň ortaça göwrüminiň düýpli üýtgewsiz galýandygyny göz öňünde tutup, biogenezi goşmaça kompensator jogap hökmünde inkär edip bolmaz. Şeýle-de bolsa, bu maglumatlar TEM tarapyndan synlanan kiçi, tegelek mitohondrial gurluşlar bilen gabat gelýär we şeýle hem PPA tarapyndan döredilen mitohondrial dinamikada möhüm üýtgeşmeleri görkezýär.
Propion turşusy (PPA) tor bitewiligini saklamak üçin dinamiki mitohondrial täzeden gurulmasyny döredýär. SH-SY5Y öýjükleri ösdürilip ýetişdirildi, 24 sagatlap 3 we 5 mM PPA bilen işlenildi we TMRE we Hoechst 33342 bilen boýaldy, soňra MEL analiz edildi. (a) Her bir ýagdaý üçin 2-nji wagtda (t2) reňkli we binarlaşdyrylan iň ýokary intensiwlik proýeksiýalaryny görkezýän wekilçilikli wagt aralygy mikroskopiýa suratlary. Her bir ikilik suratda görkezilen saýlanan sebitler wagtyň geçmegi bilen dinamikany görkezmek üçin üç dürli wagt aralygynda (t1-t3) güýçlendirilýär we 3D görnüşinde görkezilýär; birleşme wakalary ýaşyl reňkde görkezilýär; bölünme wakalary ýaşyl reňkde görkezilýär. Gyzyl reňkde görkezilýär. (b) Her bir ýagdaý üçin dinamiki wakalaryň ortaça sany. (c) Her bir öýjük üçin mitohondrial gurluşlaryň ortaça sany. (d) Her bir öýjük üçin her bir mitohondrial gurluşyň ortaça göwrümi (µm3). Görkezilen maglumatlar her bir bejeriş topary üçin n = 15 öýjük üçin wekilçilik edýär. Görkezilen ýalňyşlyk çyzyklary ortaça ± SEM-i görkezýär, ölçeg çyzygy = 10 μm, * p < 0.05.
Propion turşusy (PPA) mitohondrial dinamika bilen baglanyşykly genleriň transkripsiýa basyşyna sebäp bolýar. SH-SY5Y öýjükleri 24 sagatlap 3 we 5 mM PPA bilen bejerildi. Geniň deňeşdirme mukdary RT-qPCR ulanylyp geçirildi we B2M-e kadalaşdyryldy. Mitohondrial biogenez genleri (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 we ​​(d) NFE2L2. Mitohondrial birleşme we bölünme genleri (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 we (i) DRP1. Esasy tapawutlar (p < 0.05) bir taraply ANOVA (gözegçilik we bejergi) we Dannettiň köptaraply deňeşdirme synagy arkaly synagdan geçirildi: * p < 0.05 görkezýär, ** p < 0.01 görkezýär we **** p < 0.0001 görkezýär. Çyzyklar ortaça ekspresiýa ± SEM-i görkezýär. Görkezilen maglumatlar n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) we n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologik gaýtalanmalary görkezýär.
TEM we MEL seljermelerinden alnan maglumatlar bilelikde PPA-nyň mitohondrial morfologiýany we dinamikasyny üýtgedýändigini görkezýär. Şeýle-de bolsa, bu suratlandyryş usullary bu prosesleri herekete getirýän esasy mehanizmler barada düşünje bermeýär. Şonuň üçin biz PPA bejergisine jogap hökmünde mitohondrial dinamikanyň, biogeneziň we mitozyň dokuz esasy düzgünleşdirijisiniň mRNA ekspresiýasyny barladyk. Biz öýjük mieloma onkogenini (cMYC), ýadro dem alyş faktoryny (NRF1), mitohondrial transkripsiýa faktoryny 1 (TFAM), NFE2-e meňzeş transkripsiýa faktoryny BZIP (NFE2L2), gastrin ýaly belok 2-ni (STOML2), optik nerw atrofiýasy 1-i (OPA1), Mitofusin 1-i (MFN1), Mitofusin 2-ni (MFN2) we dinamin bilen baglanyşykly belok 1-i (DRP1) 24 sagatlap 3 mM we 5 mM PPA bilen bejergiden soň san taýdan kesgitledik. Biz 3 mM (degişlilikde p = 0.0053, p = 0.0415 we p < 0.0001) we 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA bejergisini synladyk. (3a-c surat). mRNA ekspresiýasynyň peselmegi doza baglydy: cMYC, NRF1 we ​​TFAM ekspresiýasy 3 mM-de degişlilikde 5.7, 2.6 we 1.9 esse, 5 mM-de bolsa 11.2, 3 we 2.2 esse azaldy. Tersine, merkezi redoks biogenez geni NFE2L2 PPA-nyň islendik konsentrasiýasynda üýtgemedi, emma ekspresiýanyň peselmeginiň meňzeş doza bagly meýli syn edildi (3d surat).
Şeýle hem, bölünmegiň we birleşmegiň düzgünleşdirilmegine gatnaşýan klassiki genleriň ekspresiýasyny barladyk. STOML2-niň birleşme, mitofagiýa we biogenez bilen baglanyşyklydygy çak edilýär we onuň ekspresiýasy 3 mM (2,4 esse üýtgeşiklik) we 5 mM (2,8 esse üýtgeşiklik) PPA bilen ep-esli azaldy (p < 0,0001) (1-nji surat). 3d). Şonuň ýaly-da, OPA1 birleşme geniniň ekspresiýasy 3 mM (1,6 esse üýtgeşiklik) we 5 mM (1,9 esse üýtgeşiklik) PPA-da (degişlilikde p = 0,006 we p = 0,0024) azaldy (3f-nji surat). Şeýle-de bolsa, 24 sagatlyk PPA stresinde birleşme genleri MFN1, MFN2 ýa-da bölünme gen DRP1-iň ekspresiýasynda ep-esli tapawutlar tapmadyk (3g-i surat). Mundan başga-da, biz dört sany birleşme we bölünme beloklarynyň (OPA1, MFN1, MFN2 we DRP1) derejesiniň şol bir şertlerde üýtgemedigini anykladyk (4a–d surat). Bu maglumatlaryň wagtyň bir nokadyny görkezýändigini we PPA stresiniň irki tapgyrlarynda belogyň ekspresiýasyndaky ýa-da işjeňlik derejelerindäki üýtgeşmeleri görkezmezliginiň mümkindigini bellemek möhümdir. Şeýle-de bolsa, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 we OPA1 ekspresiýasynyň ep-esli azalmagy mitohondrial metabolizmiň, biogeneziň we dinamikanyň transkripsiýa taýdan düýpli bozulmagyny görkezýär. Mundan başga-da, bu maglumatlar mitohondrial funksiýadaky soňky ýagdaýdaky üýtgeşmeleri gönüden-göni öwrenmek üçin suratlandyryş usullarynyň peýdalydygyny görkezýär.
Propion kislotasy (PPA) bilen bejergiden soň birleşme we bölünme faktory belogynyň derejesi üýtgemedi. SH-SY5Y öýjükleri 24 sagatlap 3 we 5 mM PPA bilen bejerildi. Belogyň derejesi Western blot analizi arkaly kesgitlendi we ekspresiýa derejeleri umumy beloga kadalaşdyryldy. Ortaça belogyň ekspresiýasy we nyşana we umumy belogyň wekilçilikli Western blotlary görkezilen. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Çyzyklar ortaça ± SEM-i görkezýär we görkezilen maglumatlar n = 3 biologik gaýtalanmalary görkezýär. Köp sanly deňeşdirmeler (p < 0.05) birtaraplaýyn dispersiýa analizi we Dannett synagy arkaly geçirildi. Asyl gel we blot S1 suratda görkezilen.
Mitohondrial disfunksiýa metabolik, ýürek-damar we myşsa kesellerinden newrologik kesellere çenli köpugurly keseller bilen baglanyşyklydyr1,10. Köp sanly neýrodegeneratiw we neýrodegeneratiw keseller mitohondrial disfunksiýa bilen baglanyşyklydyr, bu bolsa beýniniň ömrüniň dowamynda bu organellalaryň ähmiýetini görkezýär. Bu kesellere Parkinson keseli, Altsgeýmer keseli we ASD3,4,18 girýär. Şeýle-de bolsa, bu keselleri öwrenmek üçin beýni dokumalaryna elýeterlilik kyn, esasanam mehanistik derejede, bu bolsa öýjük model ulgamlaryny zerur alternatiwa edýär. Bu gözlegde biz neýron kesellerinde, esasanam autizm spektr bozulmalarynda syn edilýän mitohondrial disfunksiýany gaýtalamak üçin PPA bilen işlenen SH-SY5Y öýjüklerini ulanýan öýjük model ulgamyny ulanýarys. Neýronlardaky mitohondrial dinamikany öwrenmek üçin bu PPA modelini ulanmak ASD-niň etiologiýasy barada düşünje berip biler.
Biz mitohondrial morfologiýadaky üýtgeşmeleri görmek üçin TEM-i ulanmagyň mümkinçiligini öwrendik. TEM-iň netijeliligini ýokarlandyrmak üçin onuň dogry ulanylmalydygyny bellemek möhümdir. Krio-nusgalary taýýarlamak, bir wagtyň özünde öýjük böleklerini berkitmek we artefaktlaryň emele gelmegini azaltmak arkaly neýron gurluşlaryny has gowy saklamaga mümkinçilik berýär34. Muňa laýyklykda, biz neýron ýaly SH-SY5Y öýjükleriniň bitewi subhüjre organellalarynyň we uzyn mitohondriýalarynyň bardygyny gördük (1a-njy surat). Bu, neýron öýjük modellerinde mitohondrial morfologiýany öwrenmek üçin kriogen taýýarlamak usullarynyň peýdalydygyny görkezýär. TEM maglumatlarynyň obýektiw seljermesi üçin mukdary ölçegler möhüm bolsa-da, mitohondrial morfologik üýtgeşmeleri tassyklamak üçin haýsy anyk parametrleriň ölçelmelidigi barada henizem ylalaşyk ýok. Mitohondrial morfologiýany mukdary taýdan barlan köp sanly gözleglere esaslanyp17,31,32, sekiz morfologik parametri ölçeýän awtomatlaşdyrylan mitohondrial surat seljeriş geçirijisini işläp düzdik, ýagny: meýdan, meýdan2, aspekt gatnaşygy, perimetr, tegeleklik, dereje, Feret diametri. we tegeleklik.
Olaryň arasynda PPA 2-nji meýdany, meýdany, perimetri we Feret diametrini ep-esli azaltdy (1b–e surat). Bu mitohondriýanyň has kiçi we tegelek bolandygyny görkezdi, bu bolsa PPA30-yň döredýän mitohondriýa stresiniň 72 sagadyndan soň mitohondriýa meýdanynyň azalandygyny görkezýän öňki barlaglar bilen gabat gelýär. Bu morfologiki aýratynlyklar mitohondriýa bölünmegini görkezip biler, bu bolsa mitohondriýa ulgamyndan zeper ýeten bölekleri bölüp almak we olaryň mitofagiýa arkaly dargamagyny höweslendirmek üçin zerur prosesdir35,36,37. Beýleki tarapdan, ortaça mitohondriýa ululygynyň azalmagy biogeneziň artmagy bilen baglanyşykly bolup biler, bu bolsa kiçi täze dörän mitohondriýalaryň emele gelmegine getirýär. Bölünmegiň ýa-da biogeneziň artmagy mitohondriýa stresine garşy mitozy saklamak üçin kompensator jogaby aňladýar. Şeýle-de bolsa, mitohondriýanyň ösüşiniň peselmegi, birleşme bozulmagy ýa-da başga ýagdaýlary inkär edip bolmaz.
TEM tarapyndan döredilen ýokary çözgütli suratlar morfologiki aýratynlyklary aýratyn mitohondriýalaryň derejesinde kesgitlemäge mümkinçilik berse-de, bu usul wagtyň bir nokadynda iki ölçegli suratlary öndürýär. Metabolik strese dinamiki jogaplary öwrenmek üçin biz mitohondriýalary TMRE bilen boýadyk we MEL analizi bilen wagt aralygy mikroskopiýasyny ulandyk, bu bolsa wagtyň geçmegi bilen mitohondriýa ulgamyndaky üýtgeşmeleriň ýokary öndürijilikli 3D wizualizasiýasyna mümkinçilik berýär33,38. PPA stresiniň aşagynda mitohondriýa dinamikasynda inçe, ýöne möhüm üýtgeşmeleri synladyk (2-nji surat). 3 mM-de bölünme wakalarynyň sany ep-esli artdy, birleşme wakalary bolsa gözegçilikdäki ýaly galdy. 5 mM PPA-da bölünme we birleşme wakalarynyň sanynyň artmagy synlandy, ýöne bu üýtgeşmeler takmynan proporsional boldy, bu bolsa bölünme we birleşme kinetikasynyň ýokary konsentrasiýalarda deňagramlylyga ýetýändigini görkezýär (2b-nji surat). Mitohondriýanyň ortaça göwrümi 3 we 5 mM PPA-da üýtgewsiz galdy, bu bolsa mitohondriýa ulgamynyň bitewüliginiň saklanandygyny görkezýär (2d-nji surat). Bu dinamiki mitohondrial torlaryň ýeňil metabolik strese jogap berip, toruň parçalanmagyna sebäp bolmazdan gomeostazy netijeli saklamak ukybyny görkezýär. 3 mM PPA-da bölünişiň artmagy täze deňagramlylyga geçmegi höweslendirmek üçin ýeterlikdir, ýöne PPA-nyň ýokary konsentrasiýalary sebäpli döreýän strese jogap hökmünde has çuňňur kinetiki täzeden gurluş talap edilýär.
Mitohondriýalaryň sany PPA stres konsentrasiýalarynyň ikisinde-de artdy, ýöne ortaça mitohondriýa göwrümi düýpli üýtgemedi (2c-nji surat). Bu biogeneziň artmagy ýa-da bölünmegiň artmagy bilen baglanyşykly bolup biler; ýöne, ortaça mitohondriýa göwrüminiň düýpli azalmagy bolmadyk ýagdaýynda, biosinteziň artmagy has ähtimal. Şeýle-de bolsa, 2-nji suratdaky maglumatlar iki kompensator mehanizminiň bardygyny goldaýar: bölünme wakalarynyň sanynyň artmagy, mitohondriýa bölünmeginiň ýokarlanmagy bilen gabat gelýär we wakalaryň sanynyň artmagy, mitohondriýa biogenezine gabat gelýär. Ahyrsoňy, ýeňil stres üçin dinamiki kompensasiýa bölünme, birleşme, biogenez we mitofagiýa bilen baglanyşykly bir wagtda amala aşyrylýan proseslerden ybarat bolup biler. Öňki awtorlar PPA-nyň mitozy30,39 we mitofagiýa29 güýçlendirýändigini görkezseler-de, biz PPA-a jogap hökmünde mitohondriýa bölünmesiniň we birleşme dinamikasynyň täzeden gurulmagy üçin subutnama berýäris. Bu maglumatlar TEM tarapyndan synlanan morfologiki üýtgeşmeleri tassyklaýar we PPA sebäpli mitohondriýa disfunksiýasy bilen baglanyşykly mehanizmler barada has giňişleýin düşünje berýär.
TEM we MEL analizleri synlanan morfologiki üýtgeşmeleriň esasynda duran gen düzgünleşdiriji mehanizmleriň gönüden-göni subutnamasyny bermeýändigi sebäpli, biz mitohondrial metabolizm, biogenez we dinamika bilen meşgullanýan genleriň RNK ekspresiýasyny barladyk. cMYC proto-onkogeni mitohondrial transkripsiýa, terjime we kompleks ýygnamaga gatnaşýan 600-e golaý mitohondrial geniň, şol sanda NRF1 we ​​TFAM41-iň ekspresiýasyny düzgünleşdirýändigi mälim. NRF1 we ​​TFAM mitozonyň iki merkezi düzgünleşdirijisi bolup, PGC-1α-nyň aşagynda mtDNK replikasiýasyny işjeňleşdirmek üçin hereket edýär. Bu ýol cAMP we AMPK signallaşdyrmasy bilen işjeňleşdirilýär we energiýa sarp edilişine we metabolik strese duýgurdyr. Şeýle hem, PPA-nyň täsirleriniň oksidatiw stres bilen baglanyşykly bolup biljekdigini ýa-da bolup bilmejekdigini kesgitlemek üçin mitohondrial biogeneziň oksidatiw-oksudyjy düzgünleşdirijisi bolan NFE2L2-ni barladyk.
NFE2L2 ekspresiýasy üýtgewsiz galsa-da, 3 mM we 5 mM PPA bilen 24 sagat bejergiden soň cMYC, NRF1 we ​​TFAM ekspresiýasynyň yzygiderli doza bagly peselmegini tapdyk (3a–c surat). cMYC ekspresiýasynyň peselmegi ozal mitohondrial stresse jogap hökmünde habar berildi42 we tersine, cMYC ekspresiýasynyň peselmegi mitohondrial metabolizmi, tor baglanyşygyny we membrana polýarizasiýasyny täzeden gurmak arkaly mitohondrial disfunksiýa sebäp bolup biler43. Gyzykly tarapy, cMYC mitohondrial bölünmegiň we birleşmegiň düzgünleşdirilmegine hem gatnaşýar42,43 we öýjük bölünişi wagtynda DRP1 fosforilleşmesini we mitohondrial lokalizasiýany artdyrýandygy, şeýle hem neýron kök öýjüklerinde mitohondrial morfologiki täzeden gurmakda araçylyk edýändigi mälim45. Hakykatdan-da, cMYC ýetmezçilikli fibroblastlar PPA43 stressi sebäpli ýüze çykýan üýtgeşmelere laýyk gelýän mitohondrial ululygyň peselmegini görkezýär. Bu maglumatlar cMYC bilen mitohondrial dinamikanyň arasyndaky gyzykly, ýöne heniz belli bolmadyk gatnaşygy görkezýär we PPA stresiniň täsiri bilen täzeden gurulmagyň geljekki barlaglary üçin gyzykly nyşana öwrülýär.
NRF1 we ​​TFAM-yň azalmagy cMYC-niň möhüm transkripsiýa aktiwatory hökmünde roly bilen gabat gelýär. Bu maglumatlar adam içege rak keseliniň öýjüklerinde geçirilen öňki barlaglar bilen hem gabat gelýär, bu bolsa PPA-nyň 22 sagatda NRF1 mRNA ekspresiýasyny peseldendigini görkezýär, bu bolsa ATP-niň azalmagy we ROS46-nyň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydyr. Bu awtorlar şeýle hem TFAM ekspresiýasynyň 8,5 sagatda ýokarlanandygyny, ýöne 22 sagatda başlangyç derejä gaýdyp gelendigini habar berdiler. Tersine, Kim we beýlekiler (2019) SH-SY5Y öýjüklerinde 4 sagat PPA stressinden soň TFAM mRNA ekspresiýasynyň ep-esli peselendigini görkezdiler; ýöne, 72 sagatdan soň TFAM belogynyň ekspresiýasy ep-esli ýokarlandy we mtDNK nusgalarynyň sany ep-esli ýokarlandy. Şeýlelik bilen, 24 sagatdan soň syn eden mitohondrial biogenez genleriniň sanynyň azalmagy, mitohondriallaryň sanynyň artmagynyň irki wagt nokatlarynda biogeneziň aktiwleşmegi bilen baglanyşykly bolmagynyň mümkinçiligini aradan aýyrmaýar. Öňki barlaglar PPA-nyň SH-SY5Y öýjüklerinde PGC-1α mRNA-ny we belogy 4 sagat 30 minutda ep-esli ýokarlandyrýandygyny, propion turşusynyň bolsa 12 sagat 39 minutda PGC-1α arkaly buzow gepatositlerinde mitohondrial biogenezi güýçlendirýändigini görkezdi. Gyzykly tarapy, PGC-1α diňe NRF1 we ​​TFAM-yň göni transkripsiýa düzgünleşdirijisi bolmak bilen çäklenmän, eýsem bölünmegi we birleşmegi düzgünleşdirmek arkaly MFN2 we DRP1-iň işjeňligini hem düzgünleşdirýändigi görkezildi47. Jemi alnanda, bu PPA tarapyndan induksiýa edilen mitohondrial kompensator jogaplaryny düzgünleşdirýän mehanizmleriň ýakyn baglanyşygyny görkezýär. Mundan başga-da, biziň maglumatlarymyz PPA stresi astynda biogeneziň we metabolizmiň transkripsiýa düzgünleşdirilişiniň düýpli bozulmasyny görkezýär.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 we DRP1 genleri mitohondrial bölünmegiň, birleşmegiň we dinamikanyň merkezi düzgünleşdirijileriniň arasyndadyr37,48,49. Mitohondrial dinamikada gatnaşýan başga-da köp genler bar, ýöne STOML2, OPA1 we MFN2-niň öň ASD kohortlarynda dürli metillenendigi anyklandy16 we birnäçe garaşsyz gözleglerde mitohondrial strese jogap hökmünde bu transkripsiýa faktorlarynda üýtgeşmeler barada habar berildi50,51.52. OPA1-iň we STOML2-niň ekspresiýasy 3 mM we 5 mM PPA bejergisi bilen ep-esli azaldy (3e, f surat). OPA1 MFN1 we 2 bilen gönüden-göni özara täsir arkaly mitohondrial birleşmegiň klassiki düzgünleşdirijileriniň biridir we kristleriň täzeden gurulmagynda we mitohondrial morfologiýada rol oýnaýar53. STOML2-niň mitohondrial dinamikada anyk roly belli däl bolmagynda galýar, ýöne subutnamalar onuň mitohondrial birleşmegde, biogenezde we mitofagiýada rol oýnaýandygyny görkezýär.
STOML2 mitohondrial dem alyş baglanyşygyny we dem alyş zynjyr toplumlarynyň emele gelmegini saklamaga gatnaşýar54,55 we rak öýjükleriniň metabolik häsiýetlerini düýpli üýtgedýändigi görkezildi56. Barlaglar STOML2-niň BAN we kardiolipin bilen özara täsirleşmek arkaly mitohondrial membran potensialyny we biogenezi höweslendirýändigini görkezdi55, 57, 58. Mundan başga-da, garaşsyz barlaglar STOML2 bilen PINK1-iň arasyndaky özara täsiriň mitofagiýa59,60 düzgünleşdirýändigini görkezdi. Belli bir zat, STOML2-niň MFN2 bilen gönüden-göni özara täsirleşýändigi we ony durnuklaşdyrýandygy, şeýle hem OPA1-iň dargamagyna jogapkär proteaza53,61,62 päsgel bermek arkaly uzyn OPA1 izoformalaryny durnuklaşdyrmakda möhüm rol oýnaýandygy habar berildi. PPA reaksiýalarynda syn edilýän STOML2 ekspresiýasynyň peselmegi bu birleşme beloklarynyň ubikwitin we proteazoma bagly ýollar48 arkaly dargamaga has duýgur bolmagyna sebäp bolup biler. STOML2 we OPA1-iň PPA-a dinamiki reaksiýada anyk roly belli bolmasa-da, bu birleşme genleriniň ekspresiýasynyň peselmegi (3-nji surat) bölünme bilen birleşme arasyndaky deňagramlylygy bozup, mitohondrial ululygyň kiçelmegine getirip biler (3-nji surat). 1).
Beýleki tarapdan, OPA1 belogynyň ekspresiýasy 24 sagatdan soň üýtgewsiz galdy, MFN1, MFN2 ýa-da DRP1-iň mRNA we belog derejeleri bolsa PPA bejergisinden soň düýpli üýtgemedi (3g-i surat, 4-nji surat). Bu mitohondrial birleşme we bölünme bilen baglanyşykly bu faktorlaryň düzgünleşdirilişinde hiç hili üýtgeşme ýokdugyny görkezip biler. Şeýle-de bolsa, bu dört geniň her biriniň belogyň işjeňligini gözegçilik edýän posttranskripsiýa modifikasiýalary (PTM) bilen hem düzgünleşdirilýändigini bellemek gerek. OPA1-iň mitohondrial birleşmede we mitohondrial toruň saklanmagynda OPA1-iň roluny kesgitleýän sekiz alternatiw birleşme görnüşi bar63. Uzyn we gysga izoformlaryň arasyndaky deňagramlylyk, ahyrsoňy OPA1-iň mitohondrial birleşmede we mitohondrial toruň saklanmagynda roluny kesgitleýär64. DRP1 işjeňligi kalsiý/kalmoduline bagly belok kinaz II (CaMKII) fosforilleşmesi bilen düzgünleşdirilýär, DRP1-iň dargamagy bolsa ubikwitinasiýa we SUMOilleşme bilen düzgünleşdirilýär65. Ahyrsoňy, DRP1 we MFN1/2 ikisi hem GTPazalardyr, şonuň üçin işjeňlige mitohondriýalarda GTP öndürilişiniň tizligi täsir edip biler 66. Şonuň üçin, bu beloklaryň ekspresiýasy üýtgewsiz galsa-da, bu üýtgewsiz belok işjeňligini ýa-da ýerleşişini görkezmezligi mümkin 67,68. Hakykatdan-da, bar bolan PTM belok repertuarlary köplenç ýiti stress reaksiýalaryny araçylyk etmek üçin jogapkär bolan birinji gorag liniýasy bolup hyzmat edýär. Biziň modelimizde ortaça metabolik stressiň bolmagynda, PTM-iň mitohondriýanyň bitewüligini ýeterlik derejede dikeltmek üçin birleşme we bölünme beloklarynyň işjeňliginiň ýokarlanmagyna ýardam edýän bolmagy mümkin, bu bolsa mRNA ýa-da belok derejesinde bu genleriň goşmaça aktiwleşdirilmegini talap etmez.
Umumylykda, ýokardaky maglumatlar mitohondrial morfologiýanyň çylşyrymly we wagta bagly düzgünleşdirilişini we bu mehanizmleri düşündirmegiň kynçylyklaryny görkezýär. Gen ekspresiýasyny öwrenmek üçin ilki bilen ýoldaky belli bir nyşana genleri kesgitlemek zerurdyr. Şeýle-de bolsa, biziň maglumatlarymyz şol bir ýoldaky genleriň şol bir strese birmeňzeş jogap bermeýändigini görkezýär. Aslynda, öňki barlaglar şol bir ýoldaky dürli genleriň dürli wagt jogap profillerini görkezip biljekdigini görkezdi30,46. Mundan başga-da, transkripsiýa bilen gen funksiýasynyň arasyndaky gatnaşygy bozýan çylşyrymly transkripsiýadan soňky mehanizmler bar. Proteomik barlaglar PTM-leriň we belok funksiýasynyň täsiri barada düşünje berip biler, ýöne olar pes öndürijilikli usullar, ýokary signal-şowhun gatnaşyklary we pes çözgüt ýaly kynçylyklary hem döredýär.
Şu kontekstde, TEM we MEL ulanyp mitohondrial morfologiýany öwrenmek, mitohondrial dinamika bilen funksiýanyň arasyndaky gatnaşyk we munuň kesele nähili täsir edýändigi baradaky esasy soraglara jogap bermek üçin uly mümkinçilik döredýär. Iň esasysy, TEM mitohondrial disfunksiýanyň we dinamikanyň konwergent uç nokady hökmünde mitohondrial morfologiýany ölçmek üçin gönüden-göni usul hödürleýär51. MEL şeýle hem üç ölçegli öýjük gurşawynda bölünme we birleşme wakalaryny wizuallaşdyrmak üçin gönüden-göni usul hödürleýär, bu bolsa gen ekspressiýasynda üýtgeşmeler bolmasa-da, dinamiki mitohondrial täzeden gurluşyň mukdaryny kesgitlemäge mümkinçilik berýär33. Bu ýerde biz ikinji derejeli mitohondrial kesellerde mitohondrial şekillendirme usullarynyň peýdasyny nygtaýarys. Bu keseller, adatça, ýiti mitohondrial zeperlenmeden has köp mitohondrial torlaryň inçe täzeden gurluşlanmagy bilen häsiýetlendirilýän dowamly ýeňil metabolik stress bilen häsiýetlendirilýär. Şeýle-de bolsa, dowamly stress astynda mitozy saklamak üçin zerur bolan mitohondrial kompensasiýa çuňňur funksional netijelere eýedir. Neýrobiologiýa kontekstinde, bu kompensasiýa mehanizmlerini has gowy düşünmek, mitohondrial disfunksiýa bilen baglanyşykly pleiotropik neýropatologiýa barada möhüm maglumatlary berip biler.
Ahyrsoňy, biziň maglumatlarymyz gen ekspresiýasy, belok modifikasiýalary we neýron mitohondrial dinamikasyny dolandyrýan belok işjeňligi arasyndaky çylşyrymly özara täsirleriň funksional netijelerini düşünmek üçin suratlandyryş usullarynyň peýdalydygyny görkezýär. Biz ASD-niň mitohondrial bölegi barada düşünje almak üçin neýron öýjük modelinde mitohondrial disfunksiýany modelleşdirmek üçin PPA ulandyk. PPA bilen bejerilen SH-SY5Y öýjükleri mitohondrial morfologiýada üýtgeşmeleri görkezdi: mitohondrial kiçi we tegelek boldy, we TEM arkaly syn edilende kristalar gowşak kesgitlendi. MEL analizi bu üýtgeşmeleriň ýeňil metabolik strese jogap hökmünde mitohondrial ulgamy saklamak üçin bölünme we birleşme wakalarynyň köpelmegi bilen bir wagtda bolup geçýändigini görkezýär. Mundan başga-da, PPA mitohondrial metabolizmiň we gomeostazyň transkripsiýa düzgünleşdirilişini düýpli bozýar. Biz cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 we OPA1-i PPA stresi bilen bozulan esasy mitohondrial düzgünleşdirijiler hökmünde kesgitledik we mitohondrial morfologiýada we funksiýada PPA tarapyndan döredilen üýtgeşmelere araçylyk etmekde rol oýnap biler. Gen ekspresiýasynda we belok işjeňliginde, lokalizasiýada we translasiýadan soňky üýtgeşmelerde PPA tarapyndan döredilen wagtlaýyn üýtgeşmeleri has gowy häsiýetlendirmek üçin geljekki barlaglar zerurdyr. Biziň maglumatlarymyz mitohondrial stress jogabyny araçylyk edýän kadalaşdyryjy mehanizmleriň çylşyrymlylygyny we özara baglanyşygyny görkezýär we has maksatly mehanistik barlaglar üçin TEM-iň we beýleki suratlandyryş usullarynyň peýdalydygyny görkezýär.
SH-SY5Y öýjük liniýasy (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich-den satyn alyndy. SH-SY5Y öýjükleri Dulbecco-nyň üýtgedilen Eagle's ortam/F-12 iýmit garyndysynda (DMEM/F-12) we L-glutamin (SC09411, ScienCell) 25 sm2 kolbalarda 20% fetal sygyr syworotkasy (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) we 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) bilen goşulan 37 °C, 5% CO2-de ösdürilip ýetişdirildi. Öýjükler 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) ulanylyp, 300 g-da santrifuga edilip, takmynan 7 × 105 öýjük/ml dykyzlygynda örtülip, ​​80% birleşýänçä subkulturalaşdyryldy. Ähli tejribeler 19–22 geçelgeleriň arasyndaky tapawutlandyrylmadyk SH-SY5Y öýjüklerinde geçirildi. PPA NaP görnüşinde berilýär. NaP poroşogyny (CAS № 137-40-6, himiki formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ýyly MilliQ suwunda 1 M konsentrasiýa çenli erediň we 4 °C-de saklaň. Bejeriş güni bu ergini 1 M PPA bilen 3 mM we 5 mM PPA-a çenli syworotkasyz gurşawda (L-glutaminli DMEM/F-12) erediň. Ähli tejribeler üçin bejeriş konsentrasiýalary PPA (0 mM, gözegçilik), 3 mM we 5 mM PPA bolmady. Tejribeler azyndan üç biologik gaýtalamada geçirildi.
SH-SY5Y öýjükleri 25 sm5 kolbalara 5,5 × 105 öýjük/ml tizlikde ekildi we 24 sagatlap ösdürildi. PPA bejergisi inkubasiýadan 24 sagat öň kolba goşuldy. Öýjük granulalaryny süýt emdiriji dokumalarynyň adaty subkultura protokollaryna laýyklykda ýygnaň (ýokarda beýan edildi). Öýjük granulasyny 100 µl 2,5% glutaraldegid, 1× PBS-de gaýtadan eridiň we işlenýänçä 4°C-de saklaň. SH-SY5Y öýjükleri öýjükleri granulalamak we 2,5% glutaraldegid, 1× PBS erginini aýyrmak üçin gysga wagtlyk santrifuga edildi. Çökündini distillenen suwda taýýarlanan 4% agaroza gelinde gaýtadan eridiň (agarozanyň çökündi göwrümine gatnaşygy 1:1). Agaroza bölekleri tekiz tarelkalardaky torlara ýerleşdirilip, ýokary basyşly doňdurmadan öň 1-geksadsen bilen örtüldi. Nusgalar 100% gurak asetonda -90°C-de 24 sagatlap doňduryldy. Soňra temperatura -80°C-a çenli ýokarlandyryldy we 1% osmiý tetroksidiniň we 0,1% glutaraldegidiň ergini goşuldy. Nusgalar -80°C-da 24 sagat saklandy. Mundan soň, temperatura birnäçe günüň dowamynda otagyň temperaturasyna çenli ýuwaş-ýuwaşdan ýokarlandyryldy: 24 sagat - 80 °C-dan - 50 °C-a çenli, 24 sagat - 30 °C-a çenli, 24 sagat - 10 °C-a çenli we ahyrsoňy otagyň temperaturasyna çenli.
Kriogen taýýarlanandan soň, nusgalar smola bilen siňdirildi we Leica Reichert UltracutS ultramikrotomy (Leica Microsystems) ulanylyp örän inçe bölekler (~100 nm) ýasaldy. Bölekler 2% uranil asetat we gurşun sitraty bilen boýaldy. Nusgalar 200 kV-da işleýän FEI Tecnai 20 geçiriji elektron mikroskopy (ThermoFisher (öňki FEI), Eindhoven, Niderlandlar) (Lab6 geçirijisi) we Tridiem energiýa süzgüji bilen enjamlaşdyrylan Gatan CCD kamerasy (Gatan, Beýik Britaniýa) arkaly syn edildi.
Her tehniki gaýtalamada azyndan 24 sany ýeke öýjükli surat alyndy, jemi 266 surat. Ähli suratlar Gyzyklanma Sebiti (ROI) makrosy we Mitohondriýa makrosy ulanylyp seljerildi. Mitohondrial makro çap edilen usullara esaslanýar17,31,32 we Fijide/ImageJ69 TEM suratlarynyň ýarym awtomatlaşdyrylan toplu işlenmegine mümkinçilik berýär. Gysgaça aýdylanda: surat üýtgäp duran top fonuny aýyrmak (60 piksel radius) we FFT zolak geçiriji süzgüji (degişlilikde 60 we 8 piksel ýokarky we aşaky çäkleri ulanmak bilen) we 5% ugur çydamlylygy bilen dik çyzyk basyşy arkaly tersine we tersine öwrülýär. Işlenilen surat awtomatiki usulda maksimum entropiýa algoritmi ulanylyp bosaga goýulýar we ikilik maska ​​döredilýär. Çig TEM suratlarynda el bilen saýlanan ROI-ler bilen baglanyşykly surat sebitleri çykaryldy, mitohondriýalary häsiýetlendirýär we plazma membranasyny we beýleki ýokary kontrastly sebitleri aýyrýar. Her bir çykarylan ROI üçin 600 pikselden uly ikilik bölejikler seljerildi we bölejikleriň meýdany, perimetri, uly we kiçi oklary, Feret diametri, tegelekligi we tegelekligi Fiji/ImageJ-iň içerki ölçeg funksiýalary arkaly ölçeldi. Merrill, Flippo we Strack (2017)-e laýyklykda, 2-nji meýdan, bölejikleriň aspekt gatnaşygy (ulydan kiçi oklara gatnaşygy) we şekil faktory (FF) bu maglumatlardan hasaplandy, bu ýerde FF = perimetr 2/4pi x meýdan. Parametrik formulanyň kesgitlemesini Merrill, Flippo we Strack (2017)-de tapyp bolýar. Agzalan makrolar GitHub-da elýeterlidir (Maglumatlaryň Elýeterliligi baradaky Beýannama serediň). Ortaça hasap bilen, her PPA bejergisinde takmynan 5600 bölejik seljerildi, jemi takmynan 17000 bölejik (maglumatlar görkezilmedi).
SH-SH5Y öýjükleri bir gije ýapyşmagy üpjün etmek üçin 8 kameraly medeniýet gaplaryna (ThermoFisher, #155411) ýerleşdirildi we soňra TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) we Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) bilen inkubasiýa edildi. Boýamak arkaly suratlar 10 minutlyk gurşawda 405 nm we 561 nm lazerler arkaly alyndy we çig suratlar 12 soňky wagt nokadynda surat çarçuwalarynyň arasynda 0,2 μm az ädimli 10 surat mikrografyny öz içine alýan z-stekler hökmünde alyndy. Suratlar LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 linzasyny ulanyp, Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super çözgütli platformasyny (Carl Zeiss, Oberkochen, Germaniýa) ulanyp ýygnaldy. Suratlar ImageJ-de öň beýan edilen turbageçiriji we ImageJ plagini arkaly seljerilip, birleşme we bölünme wakalaryny, mitohondrial gurluşlaryň ortaça sanyny we her öýjük üçin ortaça mitohondrial göwrümini ölçemek üçin ulanyldy33. MEL makroslary GitHub-da elýeterlidir (Maglumatlaryň Elýeterliligi baradaky Beýannama serediň).
SH-SY5Y öýjükleri bejergiden öň 24 sagatlap alty guýulyk plastinkalarda 0,3 × 106 öýjük/ml dykyzlygynda ösdürilip ýetişdirildi. RNK Quick-RNA™ Miniprep protokoly (ZR R1055, Zymo Research) arkaly kiçi üýtgetmeler bilen çykaryldy: aýrylmazdan öň her guýuga 300 μl RNK lizis buferini goşuň we her nusgany soňky ädim hökmünde 30 μl DNase/RNase elusiýasy bilen lizis ediň. -suwsuz. Ähli nusgalar NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotometri arkaly mukdary we hili barlandy. Öýjük lizatlaryndan umumy belok 200 μl RIPA lizis buferi arkaly alyndy we belogyň konsentrasiýasy Bradford belok synagy arkaly kesgitlenildi70.
kDNK sintezi, öndürijiň görkezmelerine laýyklykda, käbir üýtgetmeler bilen Tetro™ kDNK sintez toplumy (BIO-65043, Meridian Bioscience) ulanylyp ýerine ýetirildi. kDNK umumy RNK-nyň 0,7-den 1 μg-a çenli ulanylyp, 20 μl reaksiýalarda sintez edildi. Primerler öň çap edilen 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 makalalaryndan (S1 tablisa) saýlanyldy we degişli zondlar Integrated DNA Technologies-den PrimerQuest guralyny ulanyp döredildi. Gyzyklanylýan ähli genler ýadro B2M genine normallaşdyryldy. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC we OPA1 genleriniň ekspresiýasy RT-qPCR arkaly ölçeldi. Esasy garyndy her reaksiýa üçin 10 μL gutarnykly göwrüm almak üçin LUNA Taq polimerazasyny (M3003L, New England Biolabs), 10 μM öňe we yzyna praýmerleri, kDNK we PZR derejeli suwy öz içine aldy. Bölüniş we bölüniş genleriniň ekspresiýasy (DRP1, MFN1/2) TaqMan multipleks synaglary arkaly ölçeldi. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) öndürijiň görkezmelerine laýyklykda kiçi üýtgetmeler bilen ulanyldy. Multipleks RT-qPCR esasy garyndysy 1X LUNA Taq polimerazasyny, 10 μM öňe we yzyna praýmerleri, 10 μM zond, kDNK we PZR derejeli suwy öz içine alýar, netijede her reaksiýa üçin 20 μL gutarnykly göwrüm emele geldi. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—seriýa belgisi: R0618110) ulanylyp ýerine ýetirildi. Sikl şertleri S1 tablisasynda görkezilen. Ähli kDNK nusgalary üç esse köpeldildi we on esse suwuklandyrmalaryň tapgyry ulanylyp standart egri döredildi. Sikl bosagasynyň standart çetleşmesi (Ct) >0.5 bolan üç esse nusgalardaky çetleşmeler maglumatlaryň gaýtalanmagyny üpjün etmek üçin seljermeden aýryldy30,72. Otnositel gen ekspresiýasy 2-ΔΔCt79 usuly arkaly hasaplandy.
Belok nusgalary (60 μg) Laemmli ýükleme buferi bilen 2:1 gatnaşykda garyşdyryldy we 12% reňksiz belok gelinde (Bio-Rad #1610184) işledildi. Beloklar Trans-Blot Turbo ulgamy (#170-4155, Bio-Rad) ulanylyp PVDF (poliwiniliden fluorid) membranasyna (#170-84156, Bio-Rad) geçirildi. Membran blokirlendi we degişli esasy antitela (OPA1, MFN1, MFN2 we DRP1) bilen 48 sagatlap inkubasiýa edildi (1:1000 suwuklandyryldy), soňra ikinji antitela (1:10,000) bilen 1 sagatlap inkubasiýa edildi. Soňra membranalar Clarity Western ECL substraty (#170-5061, Bio-Rad) ulanylyp suratlandyryldy we Bio-Rad ChemiDoc MP ulgamy arkaly ýazga alyndy. Western blot analizi üçin ImageLab 6.1 wersiýasy ulanyldy. Asyl gel we damga S1 suratda görkezilen. Antitel barada maglumat S2 tablisasynda berilýär.
Maglumatlar toplumy azyndan üç garaşsyz nusganyň ortaça bahasy we standart ýalňyşlygy (SEM) hökmünde görkezilýär. Maglumatlar toplumy Gauss paýlanyşyny we deň standart çykgytlary kabul etmezden we seljermeleri dowam etdirmezden öň, Şapiro-Wilks synagyny ulanyp (başgaça görkezilmedik bolsa) normallyk üçin synagdan geçirildi. Maglumatlar toplumyny Fişeriň MEL LSD (p < 0.05), birtaraplaýyn ANOVA (bejeriş we gözegçilik ortaça bahasy) we Dunnettiň köptaraplaýyn deňeşdirme synagyny ulanyp seljermekden başga-da, ähmiýetliligi kesgitlemek üçin (p < 0.05) ulanyldy. Esasy p gymmatlyklary grafikde *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 görnüşinde görkezilýär. Ähli statistik seljermeler we grafikler GraphPad Prism 9.4.0 ulanyp ýerine ýetirildi we döredildi.
TEM şekil analizi üçin Fiji/ImageJ makroslary GitHub-da köpçülige elýeterlidir: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitohondrial Waka Lokatory (MEL) makrosy GitHub-da köpçülige elýeterlidir: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Dewi NM we Wijaya A. Mitohondriýalar: metabolizmiň, gomeostazyň, stressiň, garramagyň we epigenetikanyň esasy düzgünleşdirijileri. Indoneziýa. Biolukmançylyk ylmy. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Şaçar, D. Şizofreniýada köpugurly mitohondrial disfunksiýa, I kompleks mümkin patologiki nyşana hökmünde. Şizofreniýa. çeşme. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. we Beal, MF Parkinson keselinde mitohondrial disfunksiýa. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Şarma VK, Singh TG we Mehta V. Stressli mitohondriýalar: Altsgeýmer keselinde inwaziýanyň nyşanalary. Mitohondriýa 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF we Ferreira GK Mitohondriýa we beýni: bioenergetika we başgalar. Neýrotoksinler. çeşme. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. we beýlekiler. Pleiotrop mitohondriýalar: mitohondriýanyň neýronlaryň ösüşine we kesellerine täsiri. J. Neýrobilim. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. we Morais, VA Neýronlarda mitohondrial biogenez: nähili we nirede. halkaralyk. J. Mohr. ylym. 22, 13059 (2021).
Ýu, R., Lendahl, U., Nister, M. we Zhao, J. Süýt emdiriji haýwanlaryň mitohondrial dinamikasynyň düzgünleşdirilmegi: mümkinçilikler we kynçylyklar. öň. endokrin. (Lozanna) 11, 374 (2020).
Khacho, M. we Slack, RS Neýrogeneziň düzgünleşdirilmeginde mitohondrial dinamika: ösüp gelýän beýniden ululara çenli. ösüş. dinamiki. 247, 47–53 (2018).