Häzirki wagtda * Häzirki salgy: Köln 50931, Germaniýa, Köln ajaýyplyk klasteriniň garrama bilen baglanyşykly kesellerde öýjük stresine garşy göreş boýunça ylmy-barlag işleri (CECAD).
Mitohondrial keselleriň neýrodegenerasiýasyna öwrülmegi gaýtaryp bolmajak hasaplanýar, sebäbi neýronlaryň metabolik plastikligi çäkli, ýöne mitohondrial disfunksiýanyň bedende neýron metabolizminiň öýjük awtonomiýasyna täsiri ýeterlik derejede öwrenilmedik. Bu ýerde biz mitohondrial birleşme dinamikasynyň bozulmagy sebäpli progressiw OXPHOS ýetmezçiligi bolan Purkinje neýronlarynyň öýjük üçin ýörite proteomyny tanyşdyrýarys. Biz mitohondrial disfunksiýanyň proteomika ulgamynda çuňňur üýtgeşmelere sebäp bolandygyny we netijede öýjük ölüminden öň takyk metabolik programmalaryň yzygiderli işjeňleşdirilmegine getirendigini anykladyk. Garaşylmadyk ýagdaýda, biz piruwat karboksilazanyň (PCx) we TCA sikliniň aralyk önümleriniň üstüni ýetirýän beýleki garrama garşy fermentleriň aýdyň induksiýasyny anykladyk. PCx-iň basylyp saklanmagy oksidatiw stressi we neýrodegenerasiýany güýçlendirdi, bu bolsa aterosklerozyň OXPHOS ýetmeýän neýronlarda gorag täsiriniň bardygyny görkezýär. Terminal degenerasiýa edilen neýronlarda mitohondrial birleşmesiniň dikeldilmegi bu metabolik häsiýetleri doly tersine öwürýär we şeýdip öýjük ölüminiň öňüni alýar. Biziň netijelerimiz mitohondrial disfunksiýa durnuklylygy berýän öň belli bolmadyk ýollary ýüze çykarýar we neýrodegenerasiýanyň keseliň soňky tapgyrlarynda hem yzyna gaýtarylyp bilinjekdigini görkezýär.
Mitohondriýanyň neýron energiýasynyň metabolizmini saklamakdaky esasy roly adam mitohondrial keselleri bilen baglanyşykly giň newrologik alamatlar bilen nygtalýar. Bu keselleriň köpüsi mitohondrial gen ekspresiýasyny düzgünleşdirýän gen mutasiýalary (1, 2) ýa-da mitohondrial dinamika bilen baglanyşykly genleriň ýok edilmegi sebäpli ýüze çykýar, bu bolsa mitohondrial DNK-nyň (mtDNK) durnuklylygyna gytaklaýyn täsir edýär (3, 4). Haýwan modellerinde geçirilen işler töweregindäki dokumalardaky mitohondrial disfunksiýa jogap hökmünde konserwatiw metabolik ýollaryň (5-7) işjeňleşdirilip bilinjekdigini görkezdi, bu bolsa bu çylşyrymly keselleriň patogenezini çuňňur düşünmek üçin möhüm maglumat berýär. Tersine, beýni mitohondrial adenozin trifosfat (ATP) önümçiliginiň umumy şowsuzlygy sebäpli ýüze çykýan belli bir öýjük görnüşleriniň metabolik üýtgeşmelerini düşünmegimiz esasydyr (8), keseliň öňüni almak ýa-da öňüni almak üçin ulanylyp bilinjek terapewtiki maksatlary kesgitlemegiň zerurdygyny nygtaýar. Neýrodegenerasiýanyň öňüni almak (9). Maglumatyň ýetmezçiligi, nerw öýjükleriniň töweregindäki dokumalaryň öýjük görnüşlerine garanyňda metabolik çeýeliginiň örän çäklidigi hasaplanylýandygydyr (10). Bu öýjükleriň sinaptiki geçişi höweslendirmek we şikeslenmelere we kesellere jogap bermek üçin neýronlara metabolitleriň berilmegini utgaşdyrmakda esasy rol oýnaýandygyny göz öňünde tutup, öýjük metabolizmini beýni dokumasynyň kyn şertlerine uýgunlaşdyrmak ukyby diýen ýaly glial öýjükler bilen çäklenýär (11-14). Mundan başga-da, beýni dokumasynyň içki öýjük heterojenligi belli bir neýron kiçi toparlarynda bolup geçýän metabolik üýtgeşmeleri öwrenmäge köp derejede päsgel berýär. Netijede, neýronlarda mitohondrial disfunksiýanyň anyk öýjük we metabolik netijeleri barada az zat mälim.
Mitohondrial disfunksiýanyň metabolik netijelerini düşünmek üçin, biz mitohondrial daşky membrananyň birleşmesiniň (Mfn2) ýok edilmegi sebäpli döreýän neýrodegenerasiýanyň dürli tapgyrlarynda Purkinje neýronlaryny (PN) bölüp aldyk. Adamlardaky Mfn2 mutasiýalary Şarko-Mari-Diş görnüşi 2A (15) diýlip atlandyrylýan mirasdüşer hereket duýgur neýropatiýasynyň bir görnüşi bilen baglanyşykly bolsa-da, syçanlarda Mfn2-niň şertli ýok edilmegi oksidlenme fosforlaşmasynyň (OXPHOS) disfunksiýa usulynyň giňden ykrar edilen induksiýasydyr. Dürli neýron alt görnüşleri (16-19) we netijede döreýän neýrodegenerasiýa fenotipi hereket bozulmalary (18, 19) ýa-da kiçi beýni ataksiýasy (16) ýaly progressiw newrologik alamatlar bilen birlikde bolýar. Etiketsiz mukdary (LFQ) proteomika, metabolomika, şekillendirme we wirusologiki usullaryň utgaşmasyny ulanmak bilen, progressiw neýrodegenerasiýanyň piruwat karboksilaza (PCx) we PN-leriň in vivo arteriosklerozyna gatnaşýan beýleki faktorlary güýçli induksiýa edýändigini görkezýäris. Fermentleriň ekspresiýasy. Bu açyşyň degişliligini barlamak üçin, biz Mfn2 ýetmezçilikli PN-lerde PCx ekspresiýasyny aýratyn peseltdik we bu operasiýanyň oksidatiw stresi güýçlendirýändigini we neýrodegenerasiýany çaltlaşdyrýandygyny anykladyk, şeýdip azoospermiýanyň öýjük ölümine metabolik uýgunlaşma berýändigini subut etdik. MFN2-niň agyr ekspresiýasy agyr OXPHOS ýetmezçiligi, mitohondrial DNK-nyň köp mukdarda sarp edilişi we görünýän ýaly mitohondrial toruň döwülmegi bilen terminal degenerasiýa PN-ni doly halas edip biler, bu bolsa neýrodegenerasiýanyň bu görnüşiniň öýjük ölüminden öň keseliň ösen tapgyrynda hem sagalyp biljekdigini has-da nygtaýar.
Mfn2 nokaut PN-lerinde mitohondriýalary wizuallaşdyrmak üçin, biz Cre-garaşly mitohondriýalaryň sary fluoressential belogy (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspresiýasyny nyşana almagyna mümkinçilik berýän syçan ştammyny ulandyk we mitohondriýa morfologiýasyny in vivo barladyk. PN-lerde Mfn2 geniniň ýok edilmeginiň mitohondriýa ulgamynyň kem-kemden bölünmegine getirjekdigini anykladyk (S1A surat) we iň irki üýtgeşme 3 hepdelik ýaşda ýüze çykdy. Tersine, Kalbindin immun boýagynyň ýitmegi bilen subut edilýän PN öýjük gatlagynyň düýpli degenerasiýasy 12 hepdelik ýaşdan öň başlamady (1-nji surat, A we B). Mitohondriýa morfologiýasyndaky iň irki üýtgeşmeler bilen neýron ölüminiň görünýän başlangyjynyň arasyndaky wagt gabat gelmezligi bizi öýjük ölüminden öň mitohondriýa disfunksiýasy sebäpli ýüze çykan metabolik üýtgeşmeleri öwrenmäge itergi berdi. Biz YFP (YFP+) ekspresirleýän PN-i (1C surat) we gözegçilik syçanlarynda (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) bölüp almak üçin fluoresensiýa arkaly aktiwleşdirilen öýjükleri bölmek (FACS) esasynda strategiýa işläp düzdik, mundan beýläk CTRL diýlip atlandyrylýar (S1B surat). YFP signalynyň deňeşdirme intensiwligine esaslanýan derweze strategiýasynyň optimizirlenmegi bize YFP+ bedenini (YFPhigh) PN-lerden PN dällerden (YFPneg) (S1B surat) ýa-da çaklanylýan fluoresans akson/dendritik böleklerden (YFPlow; S1D surat, çepde) arassalamaga mümkinçilik berýär, bu bolsa konfokal mikroskop arkaly tassyklanýar (S1D surat, sagda). Klassifikasiýa edilen ilatyň kimligini barlamak üçin biz LFQ proteomikasyny we soňra esasy komponentleriň analizini geçirdik we YFPhigh we YFPneg öýjükleriniň arasynda aýdyň tapawut bardygyny anykladyk (S1C surat). YFPhigh öýjükleri belli PN markerleriniň (ýagny Calb1, Pcp2, Grid2 we Itpr3) arassa baýlaşmagyny görkezdi (21, 22), ýöne neýronlarda ýa-da beýleki öýjük görnüşlerinde köplenç beýan edilýän beloklaryň baýlaşmadygyny görkezdi (1D surat). Garaşsyz tejribelerde ýygnalan klassifikasiýa edilen YFPhigh öýjüklerindäki nusgalaryň arasyndaky deňeşdirme korrelasiýa koeffisiýentiniň > 0.9 bolandygyny görkezdi, bu bolsa biologik gaýtalanmalaryň arasynda gowy gaýtalanmagy görkezýär (S1E surat). Gysgaça aýdylanda, bu maglumatlar mümkin bolan PN-niň ýiti we ýörite izolýasiýa edilmegi üçin meýilnamamyzy tassyklady. Ulanylan L7-cre sürüji ulgamy dogurmadan soňky ilkinji hepdede mozaika rekombinasiýasyny döredýändigi sebäpli (23), biz CTRL-den syçanlary aýyrmaga başladyk we şertli (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neýronlary ýygnadyk. Rekombinasiýa tamamlanandan soň, ol 4 hepdelik ýaşynda Mfn2cKO diýlip atlandyrylýar. Soňky nokat hökmünde, biz mitohondrial parçalanmanyň aýdyň bolmagyna garamazdan, PN gatlagy bitewi bolan 8 hepdelik ýaşy saýladyk (1B surat we S1A surat). Jemi 3013 belokyň sanyny kesgitledik, olaryň takmynan 22% -i mitohondrial proteomyň mitohondrial hökmünde ulanylmagyna esaslanýan MitoCarta 2.0 belliklerine esaslanýar (1E surat) (1E surat) (24). 8-nji hepdede geçirilen differensial gen ekspresiýa analizi ähli beloklaryň diňe 10,5% -inde düýpli üýtgeşmeleriň bolandygyny görkezdi (1F surat we S1F surat), olaryň 195-si pese gaçdy we 120-si ýokary derejede gaçdy (1F surat). Bu maglumat toplumynyň "innowasion ýol analiziniň" differensial ekspresiýa edilen genleriň esasan belli bir metabolik ýollaryň çäklendirilen toplumyna degişlidigini görkezýändigini bellemek gerek (1G surat). Gyzykly tarapy, OXPHOS we kalsiý signallaşdyrmasy bilen baglanyşykly ýollaryň peselmegi, birleşme ýetmezçiligi bolan PN-lerde mitohondrial disfunksiýanyň döremegini tassyklasa-da, esasan aminokislota metabolizmini öz içine alýan beýleki kategoriýalar ep-esli ýokarlanýar, bu bolsa mitohondrial PN-lerde bolup geçýän metabolizm bilen gabat gelýär. Gaýtadan simleriň işleýşi yzygiderli bozulmadyr.
(A) CTRL we Mfn2cKO syçanlarynyň kiçijik bölekleriniň wekilçilikli konfokal fotosuratlary PN-leriň progressiw ýitgisini görkezýär (kalbindin, çal reňk); ýadrolar DAPI bilen garşy reňklendi. (B) (A)-nyň mukdaryny kesgitlemek (dispersiýa analizi, ***P<0.001; n = üç syçandan 4-den 6-a çenli tegelek). (C) Eksperimental iş akymy. (D) Purkinje (ýokarky) we beýleki öýjük görnüşlerine (orta) mahsus markerleriň ýylylyk kartasynyň paýlanyşy. (E) Klassifikasiýa edilen PN-de anyklanan mitohondrial beloklaryň sanyny görkezýän Wenn diagrammasy. (F) 8 hepdede Mfn2cKO neýronlarynda dürli görnüşde ekspresirlenen beloklaryň wulkan diagrammasy (ähmiýetlilik kesiş bahasy 1.3). (G) Döredijilik ýolunyň analizi 8 hepde hökmünde klassifikasiýa edilen Mfn2cKO PN-de iň möhüm bäş ýokary-düzgünleşdiriş (gyzyl) we aşak-düzgünleşdiriş (gök) ýoluny görkezýär. Her bir anyklanan belogyň ortaça ekspresiýa derejesi görkezilýär. Çal reňkli ýylylyk kartasy: düzedilen P bahasy. ns, möhüm däl.
Proteomika maglumatlary I, III we IV kompleksleriniň belogynyň ekspresiýasynyň kem-kemden azalýandygyny görkezdi. I, III we IV kompleksleriniň hemmesinde mtDNK-da kodlanan möhüm kiçi birlikler bar, diňe ýadro kodlanan II kompleks bolsa, esasan täsirlenmedi (2A surat we S2A surat). . Proteomika netijelerine laýyklykda, kiçi beýni dokumasynyň bölekleriniň immunohistokimiýasynda PN-de IV kompleksiniň MTCO1 (mitohondrial sitohrom C oksidaza kiçi birligi 1) kiçi birliginiň derejesi kem-kemden azalandygy görkezildi (2B surat). mtDNK-da kodlanan Mtatp8 kiçi birligi ep-esli azaldy (S2A surat), ýadro kodlanan ATP sintaza kiçi birliginiň durnukly derejesi bolsa üýtgewsiz galdy, bu bolsa mtDNK ekspresiýasy durnukly bolanda belli bolan durnukly ATP sintaza kiçi birligi F1 kompleksi bilen gabat gelýär. Döredilme yzygiderli. Ara kesmek (7). Sortlaşdyrylan Mfn2cKO PN-lerinde mtDNK derejesiniň real wagt polimeraza zynjyr reaksiýasy (qPCR) arkaly bahalandyrylmagy mtDNK nusga sanynyň kem-kemden azalýandygyny tassyklady. Gözegçilik topary bilen deňeşdirilende, 8 hepdelik ýaşda mtDNK derejesiniň diňe 20% töweregi saklanyp galdy (2C surat). Bu netijelere laýyklykda, Mfn2cKO PN-leriniň konfokal mikroskopiýa boýagy DNK-ny anyklamak üçin ulanyldy, bu bolsa mitohondrial nukleotidleriň wagta bagly sarp edilişini görkezýär (2D surat). Biz mitohondrial belogyň dargamagyna we stress reaksiýasyna gatnaşýan käbir kandidatlaryň, şol sanda Lonp1, Afg3l2 we Clpx, şeýle hem OXPHOS kompleksiniň ýygnaýyş faktorlarynyň ýokarlanandygyny anykladyk. Apoptozda gatnaşýan beloklaryň derejesinde düýpli üýtgeşmeler ýüze çykarylmady (S2B surat). Şonuň ýaly-da, kalsiý daşamakda gatnaşýan mitohondrial we endoplazmatik retikulum kanallarynda diňe kiçi üýtgeşmeleriň bardygyny anykladyk (S2C surat). Mundan başga-da, awtofagiýa bilen baglanyşykly beloklaryň bahalandyrmasynda hiç hili düýpli üýtgeşmeler ýüze çykarylmady, bu bolsa immunohistokimiýa we elektron mikroskopiýa arkaly in vivo syn edilen awtofagosomalaryň görünýän induksiýasy bilen gabat gelýär (S3-nji surat). Şeýle-de bolsa, PN-lerde progressiw OXPHOS disfunksiýasy aýdyň ultrastruktur mitohondrial üýtgeşmeler bilen utgaşýar. 5 we 8 hepdelik Mfn2cKO PN-leriniň öýjük bedenlerinde we dendritik agaçlarynda mitohondrial klasterleri görmek bolýar we içki membrananyň gurluşy çuňňur üýtgeşmelere sezewar boldy (S4, A we B-nji suratlar). Bu ultrastruktur üýtgeşmelere we mtDNK-nyň düýpli peselmegine laýyklykda, tetrametilrodamin metil efiri (TMRM) bilen ýiti beýni beýni bölekleriniň seljermesi Mfn2cKO PN-lerinde mitohondrial membran potensialynyň düýpli peselendigini görkezdi (S4C-nji surat).
(A) OXPHOS toplumynyň ekspresiýa derejesiniň wagt boýunça seljermesi. Diňe 8 hepdede P<0.05 bolan beloklary göz öňünde tutuň (iki taraplaýyn ANOVA). Nokatly çyzyk: CTRL bilen deňeşdirilende düzediş ýok. (B) Çepde: Anti-MTCO1 antitela bilen bellenen kiçijik böleginiň mysaly (ölçeg çyzygy, 20 μm). Purkinje öýjük bedenleri tarapyndan eýelenen meýdan sary reňk bilen örtülen. Sagda: MTCO1 derejeleriniň mukdarynyň kesgitlenmegi (bir taraplaýyn üýtgeşiklik seljermesi; üç syçandan seljerilen n = 7-den 20-ä çenli öýjük). (C) tertiplenen PN-de mtDNK nusga sanynyň qPCR seljermesi (bir taraplaýyn üýtgeşiklik seljermesi; n = 3-den 7-ä çenli syçan). (D) Çepde: Anti-DNK antitela bilen bellenen kiçijik böleginiň mysaly (ölçeg çyzygy, 20 μm). Purkinje öýjük bedenleri tarapyndan eýelenen meýdan sary reňk bilen örtülen. Sag: mtDNK zeperlenmeleriniň mukdaryny kesgitlemek (dispersiýany birtaraplaýyn seljermek; üç syçandan 5-den 9-a çenli öýjük). (E) Tutuş öýjükli ýama gysgyç ýazgysynda mitoYFP + Purkinje öýjüklerini görkezýän ýiti beýniniň kesişiniň mysaly (ok). (F) IV egrisiniň mukdaryny kesgitlemek. (G) CTRL we Mfn2cKO Purkinje öýjüklerinde depolýarizasiýa tok inýeksiýasynyň wekilçilikli ýazgylary. Ýokarky yz: AP-ni işe girizen ilkinji impuls. Aşakky yz: Maksimum AP ýygylygy. (H) Postsinaptiki öz-özünden girişleriň (sPSP) mukdaryny kesgitlemek. Görnüşli ýazgy yz we onuň zum gatnaşygy (I)-de görkezilen. Üç syçandan n = 5-den 20-ä çenli öýjükde seljerilen dispersiýanyň birtaraplaýyn seljermesi. Maglumatlar ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Deşikli ýama gysgyç režimini ulanyp ýazylan öz-özünden AP-nyň wekilçilikli yzlary. Ýokarky yz: Maksimum AP ýygylygy. Aşakky yz: ýeke AP-niň zumy. (K) Ortaça we iň ýokary AP ýygylygyny (J) görä kesgitleň. Mann-Whitney synagy; n = 5 öýjük dört syçandan seljerildi. Maglumatlar ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär; möhüm däl.
8 hepdelik Mfn2cKO PN-de OXPHOS-yň aýdyň zeperlenmesi ýüze çykaryldy, bu bolsa neýronlaryň fiziologiki funksiýasynyň örän anomaliýaldygyny görkezýär. Şonuň üçin, biz OXPHOS ýetmezçilikli neýronlaryň passiw elektrik häsiýetlerini 4-5 hepdede we 7-8 hepdede ýiti kiçijik böleklerinde tutuş öýjük ýamasynyň gysgyç ýazgylaryny ýerine ýetirmek arkaly seljerdik (2E surat). Garaşylmadyk ýagdaýda, Mfn2cKO neýronlarynyň ortaça dynç alyş membran potensialy we giriş garşylygy gözegçilik toparyna meňzeşdi, emma öýjükleriň arasynda inçe tapawutlar bardy (1-nji tablisa). Şonuň ýaly-da, 4-5 hepdelik ýaşda tok-naprýaženiýe gatnaşygynda (IV egri) düýpli üýtgeşmeler tapylmady (2F surat). Şeýle-de bolsa, 7-8 hepdelik Mfn2cKO neýronlarynyň hiç biri IV režiminden (giperpolýarizasiýa tapgyry) aman galmady, bu bolsa bu soňky tapgyrda giperpolýarizasiýa potensialyna aýdyň duýgurlygyň bardygyny görkezýär. Tersine, Mfn2cKO neýronlarynda gaýtalanýan hereket potensialynyň (AP) boşalmalaryna sebäp bolýan depolýarizasiýa ediji toklara gowy çydamlylyk görkezilýär, bu bolsa olaryň umumy boşalma nusgalarynyň 8 hepdelik gözegçilik neýronlaryndan düýpli tapawutlanmaýandygyny görkezýär (1-nji tablisa we 2G surat). Şonuň ýaly-da, spontan postsinaptiki toklaryň (sPSC) ýygylygy we amplitudasy gözegçilik toparynyňky bilen deňeşdirilip bilnerdi we wakalaryň ýygylygy 4 hepdeden 5 hepdeden 7 hepdeden 8 hepde çenli ýokarlandy, şonuň ýaly artma bilen (2-nji surat, H we I). PN-lerde sinaptiki ýetişme döwri (25). Deşikli PN-leriň ýamalaryndan soň meňzeş netijeler alyndy. Bu konfigurasiýa tutuş öýjük ýamasynyň gysgyjynyň ýazgysynda bolup biljek ýaly, öýjük ATP kemçilikleriniň mümkin bolan kompensasiýasynyň öňüni alýar. Hususan-da, Mfn2cKO neýronlarynyň dynç alyş membranasynyň potensialyna we spontan ot alyş ýygylygyna täsir edilmedi (2-nji surat, J we K). Gysgaça aýdylanda, bu netijeler OXPHOS disfunksiýasy açyk bolan PN-leriň ýokary ýygylykly boşalma nusgalary bilen gowy başa çykyp bilýändigini görkezýär, bu bolsa olaryň kadaly elektrofiziologiki jogaplary saklamaga mümkinçilik berýän kompensasiýa mehanizminiň bardygyny görkezýär.
Maglumatlar ortaça ± SEM (dispersiýanyň birtaraplaýyn analizi, Holm-Sidakyň köptaraplaýyn deňeşdirme synagy; *P<0.05) görnüşinde görkezilýär. Birlik belgisi ýaýlar bilen görkezilýär.
Biz proteomika maglumatlar toplumyndaky islendik kategoriýanyň (1G surat) agyr OXPHOS ýetmezçiligine garşy durup biljek ýollary öz içine alýandygyny ýa-da almaýandygyny öwrenmäge girişdik, şonuň bilen täsirlenen PN-niň näme üçin kadaly elektrofiziologiýany saklap biljekdigini düşündirýäris (2-nji surat, E-den K-ä çenli). . Proteomika seljermesi şahalanan zynjyrly aminokislotalaryň (BCAA) katabolizmine gatnaşýan fermentleriň ep-esli derejede ýokarlanandygyny görkezdi (3A surat we S5A surat) we soňky önüm bolan asetil-KoA (KoA) ýa-da suksinil KoA arterioskleroz kislotasy (TCA) siklinde trikarboksilatlaryň üstüni ýetirip biler. Biz BCAA transaminaza 1-iň (BCAT1) we BCAT2-niň ikisiniň hem mukdarynyň ýokarlanandygyny anykladyk. Olar α-ketoglutaratdan glutamat öndürmek arkaly BCAA katabolizminiň birinji ädimini katalizleýärler (26). Şahalanan zynjyrly keto kislotasy dehidrogenaza (BCKD) toplumyny emele getirýän ähli kiçi birlikler ýokary derejede düzgünleşdirilýär (kompleks emele gelen BCAA uglerod skeletiniň soňraky we gaýtarylmaz dekarboksilleşmesini katalizleýär) (3A surat we S5A surat). Şeýle-de bolsa, tertiplenen PN-de BCAA-nyň özünde hiç hili aýdyň üýtgeşmeler tapylmady, bu bolsa bu möhüm aminokislotalaryň öýjük tarapyndan özleşdirilmeginiň artmagy ýa-da TCA sikliniň üstüni ýetirmek üçin beýleki çeşmeleriň (glýukoza ýa-da süýt kislotasy) ulanylmagy bilen baglanyşykly bolup biler (S5B surat). OXPHOS-syz PN-ler 8 hepdelik ýaşda glutamin parçalanmasynyň we transaminasiýa işjeňliginiň artandygyny hem görkezdiler, bu bolsa mitohondrial fermentleriň glutaminaza (GLS) we glutamin piruwat transaminaza 2 (GPT2)-niň ýokary derejede düzgünleşdirilmegi bilen şöhlelenip bilner (3-nji surat, A we C). GLS-iň ýokary düzgünleşdirilmeginiň birleşdirilen izoform glutaminaza C (GLS-GAC) bilen çäklenýändigini (Mfn2cKO/CTRL-iň üýtgemegi takmynan 4,5 esse, P = 0,05) we onuň rak dokumalarynda aýratyn ýokary düzgünleşdirilmeginiň mitohondrial bioenergiýa goldaw berip biljekdigini bellemek gerek. (27).
(A) Gyzgynlyk kartasy 8 hepdede görkezilen ýol üçin belok derejesiniň üýtgemesini görkezýär. (B) Anti-PCx antitelosy bilen belliklenen kiçi beýni diliminiň mysaly (ölçeg çyzygy, 20 μm). Sary ok Purkinýe öýjük bedenine görkezýär. (C) Ateroskleroz üçin möhüm dalaşgär hökmünde kesgitlenen wagt kursy belok ekspresiýa analizi (köp sanly t-test, *FDR <5%; n = 3-5 syçan). (D) Ýokarda: [1-13C]piruwat yzarlaýjysynda saklanýan belliklenen uglerodyň girmeginiň dürli usullaryny görkezýän shematik diagramma (ýagny, PDH ýa-da trans-arterial ýol arkaly). Aşakda: Skripka diagrammasy ýiti kiçi beýni dilimlerini [1-13C]piruwat bilen bellikländen soň aspartik kislotasyna, limon kislotasyna we alma kislotasyna öwrülen ýeke belliklenen uglerodyň (M1) prosentini görkezýär (jübütlenen t-test; ** P <0.01). (E) Görkezilen ýoluň toplumlaýyn wagt taryhy analizi. Diňe 8 hepdede P<0.05 bolan beloklary göz öňünde tutuň. Pyzyk çyzyk: düzediş gymmaty ýok (dispersiýanyň iki taraplaýyn seljermesi; * P <0.05; *** P <0.001). Maglumatlar ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär.
Biziň seljermämizde BCAA katabolizmi esasy ýokary düzgünleşdiriş ýollarynyň birine öwrüldi. Bu fakt TCA sikline girýän howa alyş göwrüminiň OXPHOS ýetmezçilikli PN-de üýtgedilip biljekdigini güýçli görkezýär. Bu neýron metabolik gaýtadan işlenmegiň esasy görnüşi bolup biler, bu bolsa OXPHOS-yň agyr disfunksiýasynyň saklanmagy döwründe neýron fiziologiýasyna we ýaşaýşa gönüden-göni täsir edip biler. Bu gipoteza laýyklykda, biz esasy antiaterosklerotik ferment PCx-iň ýokary düzgünleşdirilendigini (Mfn2cKO/CTRL takmynan 1,5 gezek üýtgeýär; 3A surat) anykladyk, bu bolsa piruwatyň oksaloasetata öwrülmegini katalizleýär (28), bu bolsa beýni dokumasynda bar diýlip hasaplanylýar. ... PCx-iň syn edilen ýokary regulýasiýasyny funksional taýdan barlamak üçin, biz ýiti kiçijik böleklerini [1-13C]piruwat izolýatory bilen bejerdik. Piruwat piruwatdegidrogenaza (PDH) tarapyndan oksidlenende, onuň izotop nyşany ýitip gitdi, emma piruwat damar reaksiýalary arkaly metabolizlenende TCA sikliniň aralyk önümlerine goşulýar (3D surat). Proteomika maglumatlarymyzy goldamak üçin, biz Mfn2cKO bölekleriniň aspartik turşusynda bu izolýatordan köp sanly markerleri synladyk, şol bir wagtyň özünde limon turşusy we alma turşusy hem ortaça meýile eýe boldy, ýöne ähmiýetli däl (3D surat).
MitoPark syçanlarynyň dopamin neýronlarynda mitohondrial transkripsiýa faktory A genini (Tfam) ýörite ýok edýän dopamin neýronlary sebäpli mitohondrial disfunksiýa bolan dopamin neýronlarynda (S6B surat) PCx ekspressiýasy hem ep-esli ýokarlandy (31), bu bolsa aseton kislotasynyň arteriosklerozynyň ýüze çykmagynyň bedende neýron OXPHOS-yň disfunksiýasy mahalynda düzgünleşdirilýändigini görkezýär. Arterioskleroz bilen baglanyşykly bolup biljek neýronlarda ekspressiýa edilip bilinýän özboluşly fermentleriň (32-34) OXPHOS ýetmeýän PN-lerde, mysal üçin propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), Malonil-CoA propionil-CoA-ny suksinil-CoA-a öwürýär we esasy roly piruwaty malatdan dikeltmek bolan mitohondrial alma fermenti 3 (ME3) ýaly ep-esli ýokarlanandygyny bellemek gerek (3-nji surat, A we C) (33, 35). Mundan başga-da, biz PDH-ny fosforlaşdyrýan we şeýlelik bilen işjeňsizleşdirýän Pdk3 fermentiniň ep-esli artandygyny anykladyk (36), şol bir wagtyň özünde PDH-ny işjeňleşdirýän Pdp1 fermentinde ýa-da PDH ferment toplumynyň özünde hiç hili üýtgeşme ýüze çykarylmady (3A surat). Mern2cKO PN-lerinde yzygiderli ýagdaýda, Ser293-däki PDH toplumynyň piruwatdegidrogenaza E1 komponentiniň α1 kiçi birliginiň α (PDHE1α) kiçi birliginiň fosforlaşmasy (PDH-nyň ferment işjeňliginiň öňüni alýandygy mälim) güýçlendi (S6C surat) (S6C surat). Piruwatyň damarlara elýeterliligi ýok.
Ahyrsoňy, hasabatlara görä, serin we glisin biosinteziniň super ýolunyň, baglanyşykly mitohondrial folat (1C) sikliniň we prolin biosinteziniň (1G we S5C suratlary) hemmesiniň aktiwleşdiriş prosesinde ep-esli ýokarlanýandygyny anykladyk. Daş-töweregindäki dokumalar mitohondrial disfunksiýa bilen aktiwleşýär (5-7). Bu proteomika maglumatlaryny goldaýan konfokal analiz, OXPHOS ýetmeýän PN-de, 8 hepdelik syçanlaryň kiçi beýni bölekleriniň mitohondrial folat sikliniň esasy fermenti bolan serin gidroksimetiltransferaza 2-ä (SHMT2) sezewar edilendigini görkezdi. Immun reaksiýasy möhüm (S5D suraty). 13 sany CU-glýukoza bilen inkubasiýa edilen ýiti kiçi beýni böleklerinde metabolik yzarlaýyş tejribeleri serin we prolin biosinteziniň ýokarlanmagyny has-da tassyklady, bu bolsa uglerod izoformlarynyň serine we proline akymynyň ýokarlanandygyny görkezýär (S5E suraty). GLS we GPT2 tarapyndan öňe sürülýän reaksiýalar glutamyndan glutamatyň sintezine we glutamat bilen α-ketoglutaratyň arasyndaky transaminasiýa jogapkär bolany üçin, olaryň ýokarlanmagy OXPHOS ýetmezçilikli neýronlaryň glutamata bolan isleginiň artýandygyny görkezýär. Bu proliniň artan biosintezini saklamaga gönükdirilen bolup biler (S5C surat). Bu üýtgeşmelerden tapawutlylykda, PN-spesifik Mfn2cKO syçanlaryndan kiçijik astrositleriň proteomiki analizi bu ýollaryň (ähli antiperoksidazalary öz içine alýan) ekspresiýada düýpli üýtgemeýändigini görkezdi, şeýlelik bilen bu metabolik gönükdirilişiň dargaýan PN-e selektiwdigini görkezýär (S6 surat, D-den G-e).
Gysgaça aýdylanda, bu seljermeler PN-lerde belli bir metabolik ýollaryň wagtlaýyn aktiwleşmesiniň düýpli tapawutly nusgalaryny ýüze çykardy. Neýron mitohondrial funksiýasynyň anomaliýal bolmagy irki ateroskleroza we 1C täzeden gurulmagyna (3E surat we S5C surat), hatda I we IV toplumlarynyň ekspresiýasyndaky çaklanyp bilinýän üýtgeşmelere getirip bilse-de, serine de novo sintezindäki üýtgeşmeler diňe soňky tapgyrlarda aýdyňlaşdy. OXPHOS disfunksiýasy (3E surat we S5C surat). Bu netijeler stress sebäpli mitohondrial (1C sikli) we sitoplazmatik (serin biosintezi) reaksiýasynyň TCA siklinde aterosklerozyň artmagy bilen sinergiki taýdan neýron metabolizmini täzeden şekillendirmek üçin jogap berýän yzygiderli prosesi kesgitleýär.
8 hepdelik OXPHOS ýetmezçilikli PN-ler ýokary ýygylykly gyjyndyryjy işjeňligini saklap bilýär we mitohondrial disfunksiýanyň öwezini dolmak üçin möhüm metabolik gaýtadan baglanyşyga geçip bilýär. Bu açyş, hatda şu pursatda hem bu öýjükleriň neýrodegenerasiýany gijikdirmek ýa-da öňüni almak üçin terapewtiki aralaşma alyp biljekdigi barada gyzykly mümkinçiligi döredýär. Giç. Biz bu mümkinçiligi iki garaşsyz aralaşma arkaly çözdik. Birinji usulda, biz Cre-garaşly adeno bilen baglanyşykly wirus (AAV) wektoryny döretdik, şonuň üçin MFN2 in vivo OXPHOS ýetmezçilikli PN-lerde selektiw görnüşde ekspresirlenip bilner (S7A surat). MFN2 kodlaýan AAV we fluorescent reporter geni mCherry (Mfn2-AAV) in vitro esasy neýron medeniýetlerinde barlandy, bu bolsa MFN2-niň Cre-garaşly usulda ekspresirlenmegine sebäp boldy we mitohondrial morfologiýany halas etdi, şeýdip Mfn2cKO neýronlarynda neýromutasiýanyň öňüni aldy (S7 surat, B, D we E). Soňra, biz 8 hepdelik Mfn2-AAV-ny Mfn2cKO we gözegçilik syçanlarynyň kiçi beýni korteksine stereotaktik usulda ýetirmek üçin in vivo tejribelerini geçirdik we 12 hepdelik syçanlary seljerdik (4A surat). Bejerilen Mfn2cKO syçanlary öldi (1-nji surat, A we B) (16). Wirus transduksiýasy in vivo käbir kiçi beýni tegeleklerinde PN-niň selektiw ekspresiýasyna getirdi (S7, G we H surat). Diňe mCherry (Ctrl-AAV) ekspresiýa edýän gözegçilik AAV-nyň inýeksiýasy Mfn2cKO haýwanlarynda neýrodegenerasiýa derejesine düýpli täsir etmedi. Tersine, Mfn2-AAV bilen transduksiýa edilen Mfn2cKO-laryň analizi PN öýjük gatlagynyň möhüm gorag täsirini görkezdi (4-nji surat, B we C). Hususan-da, neýron dykyzlygy gözegçilik haýwanlaryndan diýen ýaly tapawutlanmaýan ýaly (4-nji surat, B we C, we S7, H we I surat). MFN1-iň ekspresiýasy, ýöne MFN2 däl, neýron ölümini halas etmekde deň derejede täsirlidir (4C surat we S7, C we F suratlar), bu bolsa ektopiki MFN1-iň ekspresiýasynyň MFN2-niň ýetmezçiligini netijeli dolduryp biljekdigini görkezýär. Ýeke-täk PN derejesinde mundan beýläk-de geçirilen seljerme Mfn2-AAV-nyň mitohondriýanyň ultrastrukturasyny köp derejede halas edendigini, mtDNK derejelerini kadalaşdyrandygyny we anti-angiogenez marker PCx-iň ýokary ekspresiýasyny yzyna gaýtarandygyny görkezdi (4-nji surat, C-den E-ä çenli). Dynç alyş ýagdaýynda halas edilen Mfn2cKO syçanlarynyň wizual barlagy olaryň duruşynyň we hereket alamatlarynyň (S1-den S3-e hereket) gowulaşandygyny görkezdi. Netijede, bu tejribeler OXPHOS-da agyr ýetmezçilik edýän PN-lere MFN2-niň gijikdirilip gaýtadan girizilmeginiň mtDNK sarp edilişini yzyna gaýtarmak we aterosklerozy döretmek üçin ýeterlikdigini, şeýlelik bilen akson degenerasiýasynyň we neýron ölüminiň in vivo öňüni alýandygyny görkezýär.
(A) Görkezilen metabolik ýol işjeňleşdirilende MFN2 kodlaýan AAV inýeksiýasynyň tejribe tertibini görkezýän shema. (B) 8 hepdede Mfn2cKO syçanlarynda transduksiýa edilen we Kalbindin garşy antitela bilen etiketlenen 12 hepdelik kiçi beýni kesikleriniň wekilçilikli konfokal suratlary. Sag: Akson süýümleriniň ölçegi. Akson zumynyň ölçegi 450 we 75 μm. (C) Çep: AAV transduksiýa halkasynda (AAV+) Purkinje öýjük dykyzlygynyň mukdary (dispersiýanyň birtaraplaýyn analizi; n = 3 syçan). Sag: 12-nji hepdede transduksiýa edilen PN-de mtDNK fokus analizi (jübütlenmedik t-test; üç syçandan n = 6 öýjük). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Görkezilen wirus wektorlary bilen transduksiýa edilen Mfn2cKO kiçi beýni kesikleriniň PN-leriniň wekilçilikli transmission elektron mikrografiýalary. Gülgüne maska ​​dendritleriň eýeleýän meýdanyny görkezýär, sary nokatly kwadrat bolsa sag tarapda berlen zumy görkezýär; n ýadrony aňladýar. Ölçeg çyzygy, 1μm. (E) 12 hepdede PN-de transduksiýa edilen PCx boýagynyň mysalyny görkezýär. Ölçeg çyzygy, 20μm. OE, artykmaç ekspressiýa; FC, gatlak üýtgemesi.
Ahyrsoňy, biz OXPHOS disfunksiýasyny başdan geçiren PN-lerde peroksidazanyň döredýän öýjükleriň ýaşamagynyň möhümdigini öwrendik. Biz syçan PCx mRNA-syny (AAV-shPCx) ýörite nyşana alýan AAV-shRNA-ny (gysga tüýli RNA) kodlaýan mCherry döretdik we wirusy ýa-da onuň garyşdyrylan gözegçilik zäherini (AAV-scr) Mfn2cKO syçanlarynyň beýnisine sanjdyk. PCx ekspresiýasy ýokarlanan (3C surat) we PN öýjük gatlagy henizem bitewi bolan (1A surat) döwürde netijeli PCx nokdaunyny gazanmak üçin inýeksiýa dördünji hepdede geçirildi (5A surat). PCx-i nokdaun etmegiň (S8A surat) PN ölüminiň ep-esli tizlenmegine getirýändigini bellemek gerek, bu bolsa wirusa ýolugan halka bilen çäklenýär (5, B we C suratlar). PCx-iň ýokarlanmagy bilen baglanyşykly metabolik täsirleriň mehanizmini düşünmek üçin, glutationy bahalandyrmak üçin PCx-iň nokaut edilmeginden we AAV arkaly optiki biosensor Grx1-roGFP2 bir wagtda ekspresirlenenden soň PN-leriň redoks ýagdaýyny öwrendik (S8, B-D surat). Peptid redoks potensialynyň deňeşdirme üýtgemesini (38). Soňra, FLIM şertlerini barlandan soň sitoplazmatik redoks ýagdaýyndaky mümkin üýtgeşmeleri anyklamak üçin 7 hepdelik Mfn2cKO-nyň ýa-da gözegçilik çöpleriniň ýiti beýni böleklerinde iki fotonly fluoresensiýa ömürboýy şekillendirme mikroskopiýasyny (FLIM) geçirdik (S8, E-G surat). Analiz PCx ekspressiýasy bolmadyk ýeke-täk Mfn2cKO PN-leriniň okislenme derejesiniň ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi, bu bolsa diňe garyşyk shRNA-ny ekspres edýän gözegçilik neýronlaryndan ýa-da Mfn2cKO PN-lerinden tapawutlanýar (5, D we E surat). PCx ekspresiýasy peselende, ýokary derejede oksidlenen ýagdaýy görkezýän Mfn2cKO PN-leriniň prosenti üç esseden gowrak ýokarlandy (5E surat), bu bolsa PCx-iň ýokarlanmagynyň degenerasiýa edilen neýronlaryň oksidlenme-okislenme ukybyny saklaýandygyny görkezýär.
(A) Görkezilen metabolik ýol işjeňleşdirilende shPCx kodlaýan AAV inýeksiýasynyň synag tertibini görkezýän shema. (B) 4 hepdede kalsineurine garşy antitela bilen transduksiýa edilen we etiketlenen Mfn2cKO syçanlarynda 8 hepdelik kiçijik bölekleriň wekilçilikli konfokal fotosuratlary. Ölçeg çyzygy, 450μm. (C) AAV transduksiýa edilen halkalarda Purkinje öýjükleriniň dykyzlygynyň mukdaryny kesgitlemek (dispersiýanyň birtaraplaýyn analizi; n = 3-4 syçan). Maglumatlar ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär; ***P<0.001. (D) Görnüşli FLIM suraty görkezilen synag şertlerinde glutation redoks sensory Grx1-roGFP2 ekspresirleýän 7 hepdelik PN-iň ortaça ömrüni görkezýär. LUT (gözleg tablisa) gatnaşygy: ýaşaýyş wagty aralygy (pikosekundlarda). Ölçeg çyzygy, 25μm. (E) Gistogramma (D)-den (her şertde iki syçanda n=158-den 368-e çenli öýjük) Grx1-roGFP2 ömürlik gymmatlyklarynyň paýlanyşyny görkezýär. Her gistogrammanyň ýokarsyndaky daň diagrammasy: CTRL-AAV-scr-de ortaça ömürlik gymmatynyň 1 SD-den geçýän, has uzyn (gyzyl, oksidlenen) ýa-da gysga (gök, kiçeldilen) ömürlik gymmatlyklary bolan öýjükleriň sanyny görkezýär. (F) Teklip edilýän model neýron PCx-iň ýokarlanmagynyň gorag täsirini görkezýär.
Umuman alanyňda, bu ýerde berýän maglumatlarymyz MFN2-niň gaýtadan ekspresiýasynyň agyr OXPHOS ýetmezçiligi, agyr mtDNK-nyň azalmagy we adatdan daşary isle morfologiýasy bolan ösen PN-ni doly halas edip biljekdigini we şeýdip ösen kesellerde hem dowamly ösüşi üpjün edip biljekdigini görkezýär. Neýrodegenerasiýa öýjük ölüminden öňki tapgyryň gaýtaryp bolýan subutnamasyny berýär. Metabolik çeýeligiň bu derejesi neýronlaryň aterosklerozy (TCA sikliniň gaýtadan birikdirilmegi) döretmek ukyby bilen has-da nygtalýar, bu bolsa OXPHOS ýetmezçilik edýän PN-lerde PCx ekspresiýasyny basyp ýatyrýar we öýjük ölümini güýçlendirýär, şeýdip gorag rolyny oýnaýar (5F surat).
Bu gözlegde biz PN-leriň OXPHOS disfunksiýasyna jogabynyň metabolik programmalar tarapyndan işjeňleşdirilen differensial aktiwleşdiriş ýoly arkaly TCA sikliniň aterosklerozyna ýuwaş-ýuwaşdan ýakynlaşýandygyny subut etdik. Biz proteomik analizi köp sanly goşmaça usullar bilen tassykladyk we agyr mitohondrial disfunksiýa bilen kynçylyk çekende, neýronlaryň metabolik elastikligiň öň belli bolmadyk görnüşine eýedigini ýüze çykardyk. Biziň geň galmagymyza sebäp bolan zat, tutuş gaýtadan birikdiriliş prosesi hökman neýrodegenerasiýa bilen ýuwaş-ýuwaşdan we gaýtarylmaz ýagdaýda dowam edýän terminal metabolik ýagdaýy alamatlandyrmaýar, ýöne biziň maglumatlarymyz onuň öýjük ölüminden öňki tapgyrda hem tehniki neýron bolup biljekdigini görkezýär. Funksional kompensasiýa mehanizmi. Bu açyş neýronlaryň bedende metabolik plastikligiň ep-esli derejesine eýedigini görkezýär. Bu fakt MFN2-niň soňraky gaýtadan girizilmeginiň esasy metabolik markerleriň ekspresiýasyny yzyna gaýtaryp we PN degenerasiýasynyň öňüni alyp biljekdigini subut edýär. Tersine, ol aterosklerozyň öňüni alýar we nerwleri çaltlaşdyrýar. transseksual.
Biziň gözleglerimizdäki iň gyzykly netijeleriň biri, OXPHOS ýetmeýän PN-leriň arteriosklerozy aýratyn höweslendirýän fermentleri ýokarlandyrmak arkaly TCA sikliniň metabolizmini üýtgedip bilmegidir. Metabolik gaýtadan düzüliş rak öýjükleriniň umumy aýratynlygydyr, olaryň käbiri dem alyş zynjyryny herekete getirýän we lipid we nukleotid biosinteziniň öňbaşçylarynyň öndürilişini saklaýan reduksiýa ekwiwalentlerini öndürmek üçin TCA sikliniň aralyk önümlerini goşmak üçin glutamine bil baglaýar (39, 40). Ýakynda geçirilen gözleg, OXPHOS disfunksiýasyny başdan geçirýän periferik dokumalarda glutamin/glutamat metabolizminiň gaýtadan baglanyşynyň hem esasy aýratynlykdygyny görkezdi (5, 41), bu ýerde glutaminiň TCA sikline girmeginiň ugry OXPHOS şikesiniň agyrlygyna baglydyr (41). Şeýle-de bolsa, bedende neýron metabolik plastikliginiň islendik meňzeşligi we onuň kesel şertlerinde mümkin bolan ähmiýeti barada aýdyň subutnama ýok. Ýakynda geçirilen in vitro gözlegde, esasy korteks neýronlarynyň neýrogeçirijilik üçin glutamat howdanlaryny mobilizasiýa edýändigi, şeýlelik bilen metabolik stress şertlerinde oksidatiw metabolizmi we aterosklerozy höweslendirýändigi görkezildi (42). TCA sikli fermenti suksinat dehidrogenazanyň farmakologik taýdan basylyp saklanmagy bilen, piruwat karboksillenmeginiň ösdürilip ýetişdirilen beýni granula neýronlarynda oksaloasetatyň sintezini saklaýandygyna ynanýandygyny bellemek gerek (34). Şeýle-de bolsa, bu mehanizmleriň beýni dokumasy üçin fiziologiki ähmiýeti (aterosklerozyň esasan astrositler bilen çäklenýändigine ynanylýar) henizem möhüm fiziologiki ähmiýete eýedir (43). Bu ýagdaýda, biziň maglumatlarymyz bedende OXPHOS tarapyndan zaýalanan PN-leriň BCAA dargamagyna we piruwat karboksillenmegine geçip biljekdigini görkezýär, bu bolsa TCA howuz aralyk önümleriniň goşmaça iki esasy çeşmesidir. BCAA katabolizminiň neýron energiýa metabolizmasyna goşýan goşandynyň çaklanylýandygyna garamazdan, glutamat we GABA-nyň neýrogeçirijilik üçin rolundan başga-da (44), bu mehanizmler üçin in vivo subutnamalar henizem ýok. Şonuň üçin, disfunksiýaly PN-leriň aterosklerozy ýokarlandyrmak arkaly assimiliasiýa prosesi bilen baglanyşykly TCA aralyk önümleriniň sarp edilişini awtomatiki usulda kompensasiýa edip biljekdigini çaklamak aňsat. Hususan-da, aspartik kislotasyna bolan islegiň artmagyny saklamak üçin PCx-iň ýokarlanmagy zerur bolup biler, bu bolsa mitohondrial disfunksiýaly köpelýän öýjüklerde teklip edilýär (45). Şeýle-de bolsa, biziň metabolomika analizimiz Mfn2cKO PN-lerinde aspartik kislotasynyň durnukly ýagdaýyndaky derejesinde düýpli üýtgeşmeleri ýüze çykarmady (S6A surat), bu bolsa köpelýän öýjükler bilen post-mitotik neýronlaryň arasynda aspartik kislotasynyň dürli metabolik ulanylyşyny görkezýär. Disfunksiýaly neýronlarda PCx-iň ýokarlanmagynyň anyk mehanizmi in vivo häsiýetlendirilmeli bolsa-da, biz bu irki reaksiýanyň neýronlaryň oksidlenme-oksuşma ýagdaýyny saklamakda möhüm rol oýnaýandygyny görkezdik, bu bolsa kiçijik böleklerinde FLIM tejribelerinde görkezildi. Hususan-da, PN-leriň PCx-iň ýokarlanmagynyň öňüni almak has oksidlenen ýagdaýa getirip we öýjük ölümini çaltlaşdyryp biler. BCAA-nyň dargamagynyň işjeňleşdirilmegi we piruwatyň karboksillenmegi mitohondrial disfunksiýanyň periferik dokumalaryny häsiýetlendirmegiň usullary däl (7). Şonuň üçin olar OXPHOS ýetmezçiligi bolan neýronlaryň ileri tutulýan aýratynlygy bolup görünýär, hatda ýeke-täk aýratynlyk bolmasa-da, bu neýrodegenerasiýa üçin möhümdir.
Kiçi beýni keseli, adatça ataksiýa görnüşinde ýüze çykýan we köplenç PN-lere zyýan ýetirýän dürli görnüşli neýrodegenerasiýa keselidir (46). Bu neýron populýasiýasy mitohondrial disfunksiýa has-da ejiz, sebäbi syçanlarda olaryň selektiw degenerasiýasy adamyň oňurga-serebellar ataksiýasyny häsiýetlendirýän hereket alamatlarynyň köpüsini gaýtalamak üçin ýeterlikdir (16, 47, 48). Habarlara görä, mutant geni bolan transgen syçan modeli adamyň oňurga-serebellar ataksiýasy bilen baglanyşyklydyr we mitohondrial disfunksiýa eýedir (49, 50), bu bolsa PNPH-da OXPHOS ýetmezçiliginiň netijelerini öwrenmegiň möhümdigini nygtaýar. Şonuň üçin bu özboluşly neýron populýasiýasyny netijeli bölüp almak we öwrenmek has amatlydyr. Şeýle-de bolsa, PN-leriň basyşa örän duýgurdygy we tutuş kiçi beýni öýjük populýasiýasynyň pes bölegini düzýändigi göz öňünde tutulanda, köp sanly omika esasyndaky barlaglar üçin olary tutuş öýjükler hökmünde selektiw bölmek henizem kyn mesele bolup durýar. Beýleki öýjük görnüşleriniň (esasanam uly ýaşly dokumalaryň) hapalanmagynyň düýbünden ýoklugyna ýetmek mümkin däl diýen ýaly bolsa-da, aşaky akymdaky proteomika analizi üçin ýeterlik mukdarda ýaşaýşly neýronlary almak üçin FACS bilen netijeli dissosiasiýa ädimini birleşdirdik we tutuş beýniniň bar bolan maglumatlar toplumy bilen deňeşdirilende belok örtügi örän ýokary (takmynan 3000 belok) boldy (51). Bütin öýjükleriň ýaşaýşyny saklamak bilen, bu ýerde hödürleýän usulymyz diňe bir mitohondriýalardaky metabolik ýollardaky üýtgeşmeleri barlamaga däl, eýsem onuň sitoplazmatiki deňdeşlerindäki üýtgeşmeleri barlamaga hem mümkinçilik berýär, bu bolsa öýjük görnüşini baýlaşdyrmak üçin mitohondrial membrana belliklerini ulanmagy tamamlaýar. Çylşyrymly dokumalardaky mitohondriýalaryň sany üçin täze usul (52, 53). Beýan edýän usulymyz diňe bir Purkinje öýjüklerini öwrenmek bilen baglanyşykly däl, eýsem mitohondrial disfunksiýanyň beýleki modellerini goşmak bilen keselli beýnilerdäki metabolik üýtgeşmeleri çözmek üçin islendik öýjük görnüşine aňsatlyk bilen ulanylyp bilner.
Ahyrsoňy, biz bu metabolik gaýtadan düzelme prosesiniň dowamynda öýjük stresiniň esasy alamatlaryny doly yzyna gaýtaryp we neýron degenerasiýasynyň öňüni alyp biljek terapewtiki penjireni anykladyk. Şonuň üçin, bu ýerde beýan edilen gaýtadan simleşdirmegiň funksional netijelerini düşünmek, mitohondrial disfunksiýa döwründe neýronlaryň ýaşaýşyny saklamak üçin mümkin bolan bejeriş usullary barada esasy düşünjeleri berip biler. Bu prinsipiň beýleki newrologik kesellere degişliligini doly açyp görkezmek üçin beýleki beýni öýjük görnüşlerinde energiýa metabolizmindäki üýtgeşmeleri derňemäge gönükdirilen geljekki ylmy barlaglar zerurdyr.
MitoPark syçanlary öň beýan edildi (31). LoxP gapdalynda Mfn2 genleri bolan C57BL/6N syçanlary öň beýan edildi (18) we L7-Cre syçanlary bilen çakyşdyryldy (23). Netijede dörän goşa geterozigot nesiller soňra gomozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP syçanlary bilen çakyşdyrylyp, Mfn2 üçin Purkinje-spesifik gen nokautlary (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) döredildi. Jübütleşmekde Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alleli (stop-mtYFP) goşmaça çakyşmalar arkaly girizildi (20). Haýwanlar bilen geçirilýän ähli amallar Ýewropa, milli we institutsional görkezmelere laýyklykda ýerine ýetirildi we Germaniýanyň Demirgazyk Reýn-Westfaliýa ştatynyň Umwelt we Verbraucherschutz şäherindäki LandesamtfürNatur tarapyndan tassyklanyldy. Haýwanlar bilen iş şeýle hem Ýewropa Laboratoriýa Haýwan Ylymlary Assosiasiýalarynyň Federasiýasynyň görkezmelerine eýerýär.
Göwreli aýalyň boýun boşlugynyň çykmagy anesteziýa edilenden soň, syçan embriony bölünip alynýar (E13). Korteks 10 mM Hepes goşulan Hanks deňagramly duz ergininde (HBSS) bölünip alyndy we papain (20 U/ml) we sistein (1μg/ml) bolan Dulbekkonyň üýtgedilen egret ortamyna geçirildi. Dokumalary DMEM-de inkubasiýa ediň we fermentatiw siňdiriş arkaly bölünip aýrylýar. Ml) 37°C-de 20 minutlap, soňra 10% fetal sygyr syworody goşulan DMEM-de mehaniki usulda üweldi. Öýjükler 6 sm medeniýet gapda 2×106 dykyzlygynda ýa-da surat seljermesi üçin 0,5×105 öýjük/sm2 dykyzlygynda polilizin bilen örtülen aýna örtüklere ekildi. 4 sagatdan soň, ortam 1% B27 goşundysyny we 0,5 mM GlutaMax-y öz içine alýan Neurobazal syworody bolmadyk ortam bilen çalşyryldy. Soňra neýronlar synagyň dowamynda 37°C we 5% CO2 temperaturada saklandy we hepdede bir gezek iýmitlendirildi. In vitro rekombinasiýany döretmek üçin, in vitro ikinji günde neýronlary bejermek üçin aşakdaky AAV9 wirus wektorynyň 3μl (24 guýulyk medeniýet gap-gaç) ýa-da 0.5μl (24 guýulyk plastinka) ulanyldy: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalog belgisi 105530-AAV9) we AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalog belgisi 105545-AAV9).
Syçan Mfn1 we Mfn2 komplementar DNK-sy (degişlilikde Addgene plazmid #23212 we #23213-den alnan) C-terminalynda V5 yzygiderliligi (GKPIPNPLLGLDST) bilen bellenilýär we T2A yzygiderliligi arkaly mCherry bilen kadrda birleşýär. Grx1-roGFP2 Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) tarapyndan berlen sowgatdyr. Adaty klonlaşdyrma usullaryny ulanyp tdTomato kassetasyny çalşyrmak arkaly kasseta pAAV-CAG-FLEX-tdTomato esasy ulgamyna (Addgene salgylanma belgisi 28306) subklonlaşdyrylyp, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 we pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 wektorlaryny döretdi. Şeýle strategiýa pAAV-CAG-FLEX-mCherry dolandyryş wektoryny döretmek üçin ulanyldy. AAV-shPCx gurluşyny döretmek üçin, syçan PCx-i nyşana alýan shRNA-ny kodlaýan DNK yzygiderliligini öz içine alýan plazmid AAV wektory (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) gerek (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 promotorynyň gözegçiligi astynda, CMV promotorynyň gözegçiligi astynda mCherry ulanylýar. Kömekçi AAV wektorlarynyň öndürilmegi öndürijiň görkezmelerine laýyklykda amala aşyryldy (Cell Biolabs). Gysgaça aýdylanda, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) göteriji transfer plazmidini ulanyň, 293AAV öýjükleriniň-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ýa-da Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodlaýjy genini, şeýle hem AAV1 kapsid belogyny we goşmaça belogy kodlaşdyryň. Gaplama plazmid plazmidini, kalsiý fosfat usulyny ulanyp, wagtlaýyn transfeksiya ediň. Çig wirusyň üstki gatlagy gurak buz/etanol wannasynda doňdurma-ereme siklleri we fosfat buferli duzly erginde (PBS) öýjükleri lizislemek arkaly alyndy. AAV wektory kesilen ýodixanol gradientli ultrasentrifuga arkaly arassalandy (32,000 aýlanma/minutda we 4°C-de 24 sagat) we Amicon ultra-15 merkezden gaçyryjy filtr arkaly konsentrlendi. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genom nusgasy (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX genom titri öň beýan edilişi ýaly (54), hakyky wagt mukdary PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) we AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) arkaly ölçeldi.
Ilkinji neýronlar buz ýaly sowuk 1x PBS-de gyrylyp alyndy, granulalara bölündi we soňra fosfataza we proteaza ingibitoryny (Roche) öz içine alýan 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriý deoksiholat/PBS lizis buferinde gomogenleşdirildi. Beloklaryň mukdary bisinhonin turşusy synagy (Thermo Fisher Scientific) arkaly kesgitlenildi. Soňra beloklar SDS-poliakrilamid gel elektroforezi arkaly bölündi we soňra poliwiniliden fluorid membranasyna (GE Healthcare) basyldy. Spesifik däl ýerleri blokirläň we esasy antitela (jikme-jik maglumat üçin S1 tablisasyna serediň) 5% süýtde TBST-de (Tween bilen Tris-buferli duzly ergin), ýuwuş tapgyrlarynda we TBST Incubate-de ikinji antitela bilen inkubasiýa ediň. Esasy antitela bilen +4°C temperaturada bir gije inkubasiýa ediň. Ýuwulandan soň, ikinji antitela otag temperaturasynda 2 sagatlap ulanyň. Soňra, şol bir bloty anti-β-aktin antitela bilen inkubasiýa etmek arkaly şol bir ýüklenme tassyklanyldy. Hemiluminessensiýa öwürmek we hemiluminessensiýany güýçlendirmek arkaly anyklamak (GE Healthcare).
Öň aýna örtük örtüklerine ekilen neýronlar görkezilen wagt nokadynda otag temperaturasynda 10 minutlap 4% paraformaldegid (PFA)/PBS bilen berkidildi. Örtük örtükleri ilki otag temperaturasynda 5 minutlap 0,1% Triton X-100/PBS bilen, soňra bolsa blokirleýji buferde [3% sygyr syworotkasy albumin (BSA)/PBS] siňdirilýär. Ikinji gün örtük örtükleri blokirleýji bufer bilen ýuwuldy we degişli fluorofor bilen birleşdirilen ikinji antitela bilen otag temperaturasynda 2 sagatlap inkubasiýa edildi; ahyrsoňy, nusgalar PBS-de 4′,6-diamidino-2-Fenilindol (DAPI) bilen gaýtadan boýalyp, soňra mikroskop slaýdyna Aqua-Poly/Mount bilen berkidildi.
Syçanlara (erkek we urkaçy) ketamin (130 mg/kg) we ksilazin (10 mg/kg) garyn boşlugyna inýeksiýa arkaly anesteziýa berildi we deri astyna karprofen agyryny aýyrýan serişde (5 mg/kg) berildi. Şeýle hem ýyly ýastykça bilen üpjün edilen stereotaktik gurala (Kopf) ýerleşdirildi. Kelleni açyp, diş burgusyny ulanyp, kiçi beýni korteksiniň kiçi süňk bilen gabat gelýän bölegini inçeldiň (lambdadan: guýruk 1.8, gapdal 1, IV we V böleklerine laýyk gelýär). Aşakdaky damar ulgamynyň bozulmazlygy üçin kellede kiçi deşik döretmek üçin egri şpris iňňesini ulanyň. Soňra inçe çekilen aýna kapillýar mikro deşige ýuwaşlyk bilen girizilýär (dura materiň ventral tarapynda -1.3-den -1-e çenli) we 200-300 nl AAV el şprisleri (Narishige) bilen mikro inýeksiýa (Narishige) 10-20 minut aralygynda pes basyşda birnäçe gezek girizilýär. Infuziondan soň, wirusyň doly ýaýramagy üçin kapillýary ýene-de 10 minut goýuň. Kapilýarlar aýrylandan soň, ýaranyň iltihabyny azaltmak we haýwanyň sagalmagy üçin deri üns bilen tikilýär. Operasiýadan soň haýwanlara birnäçe günläp agyryny aýyrýan serişdeler (kaspofen) berildi, şol wagtyň dowamynda olaryň fiziki ýagdaýy üns bilen gözegçilik edildi we soňra görkezilen wagtda ewtanaziý edildi. Ähli amallar Ýewropa, milli we edara görkezmelerine laýyklykda geçirildi we Germaniýanyň Demirgazyk Reýn-Westfaliýa ştatynyň Umwelt we Verbraucherschutz şäherindäki LandesamtfürNatur tarapyndan tassyklanyldy.
Haýwanlara ketamin (100 mg/kg) we ksilazin (10 mg/kg) bilen anesteziýa berildi we ýürek ilki 0,1 M PBS bilen, soňra bolsa PBS-de 4% PFA bilen perfuzirlendi. Dokumalar kesilip, 4°C-de gijesine 4% PFA/PBS-de fiksirlenen. PBS-de fiksirlenen beýniden sagittal bölekleri (50 μm galyňlykda) taýýarlamak üçin titreýän pyçak (Leica Microsystems GmbH, Wena, Awstriýa) ulanyldy. Başgaça görkezilmedik bolsa, erkin ýüzýän bölekleriň reňklenmegi ýokarda beýan edilişi ýaly (13) otag temperaturasynda we garyşdyrylyp ýerine ýetirildi. Gysgaça aýdylanda, ilki bilen alnan bölekler 0,5% Triton X-100/PBS bilen otag temperaturasynda 15 minutlap geçirgendirildi; käbir epitoplar (Pcx we Shmt2) üçin 80°C-de (PH 9) tris-EDTA buferinde bölekler bu ädimiň ýerine 25 minutlap gyzdyryldy. Soňra, bölekler esasy antitela (S1 tablisasyna serediň) bilen blokirleýji buferde (3% BSA/PBS) 4°C temperaturada bir gije garyşdyryp inkubasiýa edildi. Ertesi gün bölekler blokirleýji bufer bilen ýuwuldy we degişli fluorofor bilen birleşdirilen ikinji antitela bilen otagyň temperaturasynda 2 sagatlap inkubasiýa edildi; ahyrsoňy, bölekler PBS-de doly ýuwuldy, DAPI bilen reňklendi we soňra mikroskop slaýdynda AquaPolymount bilen berkidildi.
Nusgany suratlandyrmak üçin ak ýagtylyk lazeri we 405 diodly ultramelewşe lazer bilen enjamlaşdyrylan lazer skanerleýji konfokal mikroskop (TCS SP8-X ýa-da TCS sanly ýagtylyk kagyzy, Leica Microsystems) ulanyldy. Fluorofory gyjyndyryp we signaly Gibrid Detektor (HyDs) bilen ýygnamak arkaly, LAS-X programma üpjünçiligi yzygiderli re inimde Nyquist nusgalamasyna laýyk gelýän üst-üste goýlan suratlary ýygnamak üçin ulanyldy: mukdar taýdan däl paneller üçin bu ýokary dinamiki signallardyr (meselem, somatik öýjüklerde we dendritlerde) mtYFP) BrightR re iniminde PN-leriň sanyny anyklamak üçin HyD ulanyň). Fon çyzgyny azaltmak üçin 0,3-den 6 ns-e çenli derweze ulanylýar.
Sortlanan öýjükleriň hakyky wagt režiminde suratlandyrylmagy. 1% B27 goşundysy we 0,5 mM GlutaMax bolan Neurobasal-A gurşawynda saralanandan soň, öýjükler derrew poli-l-lizin bilen örtülen aýna slaýdlara (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalog belgisi 80826) ekildi. Soňra öýjükleriň çökmegine rugsat bermek üçin ony 37°C we 5% CO2-de 1 sagatlap sakladylar. Hakyky wagt režiminde suratlandyrylma ak lazer, HyD, 63×[1,4 sanly apertura (NA)] ýagly obýektiw linzasy we gyzdyryjy tapgyr bilen enjamlaşdyrylan Leica SP8 lazer skanerleýji konfokal mikroskopda geçirildi.
Syçana çaltlyk bilen uglerod dioksidi bilen anesteziýa berildi we kellesi kesildi, beýnisi çaltlyk bilen kelleden aýryldy we 200μm galyňlykda (13C etiketleme tejribesi üçin) ýa-da 275μm galyňlykda (iki foton tejribesi üçin) sagittal böleklere bölündi, aşakdaky materiallar bilen dolduryldy. Dondurma (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germaniýa) aşakdaky maddalar bilen dolduryldy: 125 mM buz ýaly sowuk, uglerod bilen doýgun (95% O2 we 5% CO2) az Ca2 + emeli beýni-omurga suwuklygy (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25 mM NaHCO3, 25 mM glýukoza, 0.5 mM CaCl2 we 3.5 mM MgCl2 (osmotik basyş 310-dan 330 mmol-a çenli). Alnan beýni böleklerini ýokary Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glýukoza, 1.0 mM CaCl2 we 2.0 mM MgCl2) orta (pH 7.4 we 310-dan 320 mmol-a çenli) saklaýan öňünden inkubasiýa kamerasyna geçiriň.
Suratlandyryş prosesinde kesikler ýörite suratlandyryş otagyna geçirildi we tejribe 32° - 33°C aralygyndaky yzygiderli temperaturada üznüksiz ACSF perfuziýasy astynda geçirildi. Kesik suratlandyryş üçin Leica 25x obýektiw linzasy (NA 0.95, suw), Ti: Sapphire lazeri (Chameleon Vision II, Coherent) bilen enjamlaşdyrylan köpfotonly lazer skanerleme mikroskopy (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ulanyldy. FLIM moduly (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-niň FLIM-i. PN-leriň sitoplazmatiki redoks ýagdaýynyň üýtgeşmeleri sagittal beýni böleklerinde iki fotonly FLIM arkaly ölçeldi, bu ýerde Grx1-roGFP2 biosensory PN-leri nyşana aldy. PN gatlagynda, ýaşaýşa ukyply PN-niň (ýagny dendritler boýunça monjuk görnüşli gurluşyň ýa-da neýron morfologiki üýtgeşmeleriň ýoklugy) we shRNA PCx-i ýa-da onuň dolandyryş yzygiderliligini (her biri mCherry-ni bilelikde beýan edýän) kodlaýan goşa oňyn roGFP2 sensory we AAV-nyň bardygyna göz ýetirmek üçin bölek ýüzüniň takmynan 50-80 μm aşagynda satyn alyş meýdany saýlanýar. 2x sanly zum bilen bir gatlakly suratlary ýygnaň [gyjyndyryjy tolkun uzynlygy: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Anyklama: içki HyD, fluoresein izotiosianat (FITC) süzgüç topary] we egri gabat getirmek üçin ýeterlik fotonlaryň ýygnalmagyny (jemi 1000 foton) üpjün etmek üçin 2-3 minut içinde ortaça surat ulanylýar. Grx1-roGFP2 zondunyň duýgurlygy we FLIM şertleriniň barlanmagy perfuzion ACSF-e ekzogen 10 mM H2O2 goşulanda (okislenme derejesini ýokarlandyrmak üçin, ömrüň uzaldylmagyna getirýär), soňra bolsa 2 mM ditiotreitol goşmak arkaly roGFP2-niň ömrüniň gymmatyny gözegçilik etmek arkaly amala aşyryldy (reduksiýa derejesini iň pes derejä düşürýär, netijede ömrüň azalmagyna getirýär) (S8 surat, D-den G-ä çenli). Alnan netijeleri seljermek üçin FLIMfit 5.1.1 programma üpjünçiligini ulanyň, tutuş suratyň ýeke eksponensial pese gaçma egrisini ölçenen IRF-e (guralyň jogap funksiýasy) laýyk getiriň we χ2 takmynan 1-e deňdir. Bir PN-iň ömrüniň dowamlylygyny hasaplamak üçin nerw bedeniniň töweregindäki maska ​​el bilen çekildi we her maskadaky ortaça ömür mukdary san taýdan kesgitlemek üçin ulanyldy.
Mitohondrial potensial seljermesi. Ýiti bölek perfuzirlenen ACSF-e gönüden-göni goşulan 100 nM TMRM bilen 30 minutlap inkubasiýa edilenden soň, PN-leriň mitohondrial potensial üýtgeşmeleri iki fotonly mikroskop arkaly ölçeldi. TMRM suratlandyrmasy zondy 920 nm-de gyjyndyryp we signallary ýygnamak üçin içki HyD (tetrametilrodamin izotiosiyanat: 585/40 nm) ulanyp ýerine ýetirildi; şol bir gyjyndyrma tolkun uzynlygyny ulanyp, ýöne mtYFP suratlandyrmak üçin başga bir içki HyD (FITC: 525/50) ulanylyp. Mitohondrial potensialy ýeke öýjük derejesinde bahalandyrmak üçin ImageJ-iň Surat Kalkulýatorynyň plaginini ulanyň. Gysgaça aýdylanda, plagini deňlemesi: signal = min (mtYFP, TMRM) degişli kanalyň bir gat konfokal suratynda Purkinje Somali-de TMRM signalyny görkezýän mitohondrial sebiti kesgitlemek üçin ulanylýar. Soňra dörän maskadaky piksel meýdany san taýdan kesgitlenýär we soňra mitohondrial potensialy görkezýän mitohondrial fraksiýany almak üçin mtYFP kanalynyň degişli bosaga bir gatlakly suratynda normallaşdyrylýar.
Surat Huygens Pro (Ylmy göwrümli suratlandyryş) programma üpjünçiligi bilen çözüldi. Plitalaryň skanirlenen suratlary üçin, ýeke-täk plitanyň montajy LAS-X programma üpjünçiligi tarapyndan üpjün edilen awtomatiki tikiş algoritmi arkaly amala aşyrylýar. Surat kalibrlenenden soň, suraty has-da işläp, ýagtylygy we kontrasty deň derejede sazlamak üçin ImageJ we Adobe Photoshop ulanyň. Grafik taýýarlamak üçin Adobe Illustrator ulanyň.
mtDNK fokus analizi. mtDNK zeperlenmeleriniň sany konfokal mikroskop arkaly DNK-a garşy antitela bilen belliklenen kiçijik böleklerde san taýdan kesgitlendi. Her bir nyşana meýdany öýjük bedeni we her öýjük ýadrosy üçin döredildi we degişli meýdan Multi Measure plagini (ImageJ programma üpjünçiligi) arkaly hasaplanyldy. Sitoplazmatik meýdany almak üçin öýjük bedeni meýdanyndan ýadro meýdanyny aýyryň. Ahyrsoňy, bosaga suratynda mtDNK-ny görkezýän sitoplazmatik DNK nokatlaryny awtomatiki usulda san taýdan kesgitlemek üçin Analyze Particles plagini (ImageJ programma üpjünçiligi) ulanyldy we alnan netijeler CTRL syçanlarynyň PN ortaça derejesine kadalaşdyryldy. Netijeler öýjük başyndaky nukleozidleriň ortaça sany hökmünde görkezilýär.
Belok ekspresiýasynyň seljermesi. PN-de belogyň ekspresiýasyny ýeke öýjük derejesinde bahalandyrmak üçin ImageJ-iň Image Calculator plaginini ulanyň. Gysgaça aýdylanda, degişli kanalyň bir gatlakly konfokal suratynda, signal = min (mtYFP, antitela) deňlemesi arkaly Purkinadaky belli bir antitela garşy immunoreaktiwligi görkezýän mitohondrial sebit kesgitlenýär. Soňra netijede dörän maskadaky piksel meýdany san taýdan kesgitlenýär we soňra görkezilen belogyň mitohondrial bölegini almak üçin mtYFP kanalynyň degişli bosaga bir gatlakly suratynda normallaşdyrylýar.
Purkinje öýjükleriniň dykyzlygynyň seljermesi. ImageJ-iň öýjük hasaplaýjy plagini, sanalan Purkinje öýjükleriniň sanyny sanalan öýjükler tarapyndan eýelenen kiçijik halkasynyň uzynlygyna bölmek arkaly Purkinje dykyzlygyny bahalandyrmak üçin ulanyldy.
Nusga taýýarlamak we ýygnamak. Gözegçilik toparynyň we Mfn2cKO syçanlarynyň beýnileri 0,1 M fosfat buferinde (PB) 2% PFA/2,5% glutaraldegidde berkidildi, soňra koronal kesikler kirpikler (Leica Mikrosysteme GmbH, Wena, Awstriýa) ulanylyp taýýarlanyldy (galyňlygy 50-60 μm). Soňra PB buferinde 1% os tetraoksid we 1,5% kaliý ferrosianidde otag temperaturasynda 1 sagatlap berkidildi. Kesikler üç gezek distilled suw bilen ýuwuldy we soňra 20 minutlap 1% uranil asetat saklaýan 70% etanol bilen boýaldy. Soňra kesikler graduslanan spirtde suwsuzlandyryldy we kremniý bilen örtülen aýna slaýdlarynyň arasyna Durcupan ACM (Araldit döküm reçinesi M) epoksi reçinesine (Elektron Mikroskopiýa Ylymlary, katalog belgisi 14040) goýuldy we ahyrsoňy 60°C-de peçde 48 sagatlap polimerleşdirildi. Beýni kiçijik korteksiniň meýdany saýlanyldy we 50 nm ultrainçe bölekler Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wena, Awstriýa) enjamynda kesilip, polistirol plýonkasy bilen örtülen 2×1 mm mis ýaryk torunda saýlanyldy. Bölekler 10 minutlap H2O-daky 4% uranil asetatyň ergini bilen boýaldy, birnäçe gezek H2O bilen ýuwuldy, soňra 10 minutlap H2O-daky Reynolds gurşun sitraty bilen ýuwuldy we soňra birnäçe gezek H2O bilen ýuwuldy. Mikrograflar TVIPS (Tietz wideo we surat işläp çykarmak ulgamy) TemCam-F416 sanly kamerasy (TVIPS GmbH, Gauting, ABŞ) ulanylyp, Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) geçirijilik elektron mikroskopy bilen alyndy.
AAV bilen ýokançlanan syçanlarda beýni bölünip, 1 mm galyňlykdaky sagittal böleklere bölündi we kiçi beýni AAV bilen ýokançlanan halkany (ýagny mCherry ekspressiýasyny) kesgitlemek üçin fluoresensiýa mikroskopy arkaly barlandy. Diňe AAV inýeksiýasynyň azyndan iki yzygiderli kiçi beýni halkasynda Purkinje öýjük gatlagynyň (ýagny tutuş gatlagyň diýen ýaly) örän ýokary geçirijilik netijeliligine getirýän tejribeleri ulanylýar. AAV bilen geçirilen halka gijesine fiksasiýadan soň mikrodissektirlendi (0,1 M kokoat buferinde 4% PFA we 2,5% glutaraldegid) we has giňişleýin işlenildi. EPON goýmak üçin, fiksirlenen dokuma 0,1 M natriý kokoat buferi (Applichem) bilen ýuwuldy we 0,1 M natriý kokoat buferinde (Applichem) 2% OsO4 (os, Ylym Hyzmatlary; Caco) bilen 4 sagat inkubasiýa edildi, soňra 2 sagat ýuwuldy. 0,1 M kokamid buferi bilen 3 gezek gaýtalaň. Soňra etanolyň ýokary seriýasy her bir etanol erginini 4°C-da 15 minutlap inkubasiýa etmek üçin dokumalary suwsuzlandyrmak üçin ulanyldy. Dokuma propilen oksidine geçirildi we 4°C-da EPON-da (Sigma-Aldrich) gije inkubasiýa edildi. Dokumany otag temperaturasynda 2 sagatlap täze EPON-a goýuň, soňra ony 62°C-da 72 sagatlap goýuň. 70 nm ultra inçe bölekleri kesmek üçin ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) we almaz pyçagy (Diatome, Biel, Şweýsariýa) ulanyň we 37°C-da 15 minutlap 1,5% uranil asetat bilen boýaň we 4 minutlap gurşun sitrat erginini boýaň. Elektron mikrograflar Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) we DigitalMicrograph programma üpjünçiligi (Gatan) bilen enjamlaşdyrylan JEM-2100 Plus geçiriji elektron mikroskopy (JEOL) arkaly alyndy. Analiz üçin 5000× ýa-da 10,000× sanly zum bilen elektron mikrograflar alyndy.
Mitohondriýanyň morfologiki analizi. Ähli analizler üçin, aýry-aýry mitohondriýanyň konturlary ImageJ programma üpjünçiligini ulanyp sanly suratlarda el bilen çyzyldy. Dürli morfologiki parametrler analiz edilýär. Mitohondriýanyň dykyzlygy her bir öýjügiň umumy mitohondriýa meýdanyny sitoplazma meýdanyna (sitoplazma meýdany = öýjük meýdany-öýjük ýadrosynyň meýdany) × 100 bölmek arkaly alnan göterim hökmünde görkezilýär. Mitohondriýanyň tegelekligi [4π∙(meýdan/perimetr 2)] formulasy bilen hasaplanýar. Mitohondriýanyň islendik morfologiýasy analiz edildi we esasy görnüşlerine görä iki kategoriýa ("turba şekilli" we "köpürjik") bölündi.
Awtofagosoma/lizosoma sany we dykyzlyk seljermesi. Sanly suratda her bir awtofagosomanyň/lizosomanyň konturlaryny el bilen kesgitlemek üçin ImageJ programma üpjünçiligini ulanyň. Awtofagosoma/lizosoma meýdany her bir öýjügiň umumy awtofagosoma/lizosoma gurluş meýdanyny sitoplazma meýdanyna (sitoplazma meýdany=öýjük meýdany-ýadro meýdany) × 100 bölmek arkaly hasaplanýan göterim hökmünde görkezilýär. Awtofagosomalaryň/lizosomalaryň dykyzlygy umumy sany her öýjükdäki awtofagosoma/lizosoma gurluşlarynyň sanyna (sitoplazma meýdany boýunça) bölmek arkaly hasaplanýar (sitoplazma meýdany = öýjük meýdany-ýadro meýdany).
Ýiti kesimleri bölmek we nusga taýýarlamak üçin etiketkalamak. Glýukoza etiketkasyny talap edýän tejribeler üçin, ýiti beýni böleklerini doýgun uglerod (95% O2 we 5% CO2), ýokary Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glýukoza, 1.0 mM CaCl2 we 2.0 mM MgCl2, pH 7.4-e we 310-dan 320 mOsm-e çenli sazlanan) saklaýan inkubasiýadan öňki kamera geçiriň, onda glýukoza 13C6- Glýukoza ornuny tutýar (Eurisotop, katalog belgisi CLM-1396). Piruwat belligi talap edýän tejribeler üçin, ýiti beýni böleklerini ýokary Ca2 + ACSF-e (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glýukoza, 1.0 mM CaCl2) geçirip, 2.0 mM MgCl2 goşuň, pH 7.4-e we 310-dan 320 mOsm-a çenli sazlaň we 1 mM 1-[1-13C]piruwat (Eurisotop, katalog belgisi CLM-1082) goşuň. Bölümleri 37°C-de 90 minutlap inkubasiýa ediň. Tejribäniň ahyrynda bölekler 75 mM ammonium karbonat saklaýan suwly ergin (pH 7.4) bilen çalt ýuwuldy we soňra 40:40:20 (v:v:v) asetonitrilde (ACN): metanol: suwda gomogenleşdirildi. Bölekler buzda 30 minutlap inkubasiýa edilenden soň, nusgalar 21,000 g-da 4°C-da 10 minutlap sentrifuga edildi we arassa üstki gatlak SpeedVac konsentratorynda guradyldy. Netijede dörän guradylan metabolit granulasy analiz edilýänçä -80°C-da saklandy.
13 sany C-bellikli aminokislotalaryň suwuk hromatografiýa-mass spektrometriýa analizi. Suwuk hromatografiýa-mass spektrometriýa (LC-MS) analizi üçin metabolit granulasy 75 μl LC-MS derejeli suwda (Honeywell) gaýtadan suspenziýa edildi. 21,000 g-da 4°C-da 5 minutlap santrifugadan soň, aminokislota akymynyň analizi üçin 20 μl arassalanan üstki gatlak ulanyldy, ekstraktyň galan bölegi bolsa derrew anion analizi üçin ulanyldy (aşakda serediň). Aminokislota analizi öň beýan edilen benzoil hloridiň türewleşdirme protokoly arkaly geçirildi (55, 56). Birinji ädimde, 20 μl metabolit ekstraktyna 10 μl 100 mM natriý karbonaty (Sigma-Aldrich) goşuldy, soňra LC derejeli ACN-e 10 μl 2% benzoil hlorid (Sigma-Aldrich) goşuldy. Nusga gysga wagtlap worteks edildi we soňra 21,000 g-da 20°C-da 5 minutlap santrifuga edildi. Arassalanan üstki gatlagy konus şekilli aýna goýulýan (200 μl göwrümli) 2 ml awtosampler flakonyna geçiriň. Nusgalar Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ýokary çözgütli takyk massa spektrometrine (Thermo Fisher Scientific) birikdirilen Acquity iClass ultra-ýokary öndürijilikli LC ulgamy (Waters) arkaly seljerildi. Seljerme üçin, alnan nusganyň 2 μl bölegi 1,8 μm bölejikleri öz içine alýan 100 × 1,0 mm ýokary berklikli silika T3 sütünine (Waters) sanjyldy. Akym tizligi 100 μl/min we bufer ulgamy A buferinden (10 mM ammonium formaty we suwda 0,15% formik kislota) we B buferinden (ACN) ybarat. Gradient aşakdaky ýaly: 0 minutda 0%B; 0%B. 0-dan 0,1 minutda 0-dan 15% B; 0,1-den 0,5 minutda 15-den 17% B; 0,5-den 14 minutda 17-den 55% -e çenli; 14-den 14,5 minutda 55-den 70% -e çenli; 18 minutda 14,5-den 70-e çenli; 18-den 19 minutda 100% B; 19-dan 19,1 minutda 100-den 0% -e çenli; 19,1-den 28 minutda 0% B (55, 56). QE-HF massa spektrometri m/z (massa/zarýad gatnaşygy) massa diapazony 50-den 750-ä çenli pozitiw ionlaşma režiminde işleýär. Ulanylýan çözgüt 60,000, alnan güýçlendirme gözegçiligi (AGC) ion nyşany 3×106, iň ýokary ion wagty bolsa 100 millisekunt. Gyzdyrylan elektropüskürtme ionlaşmasy (ESI) çeşmesi 3,5 kV püskürtme naprýaženiýesinde, kapillýar temperatura 250°C, örtük howa akymy 60 AU (islegli birlikler) we kömekçi howa akymy 20 AU. 250°C işleýär. S linzasy 60 AU-a sazlanan.
13C belgili organiki kislotalaryň anion hromatografiýasy-MS analizi. Galan metabolit çökündisi (55μl) QE-HF massa spektrometrine (Thermo Fisher Scientific) birikdirilen Dionex ion hromatografiýa ulgamy (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) arkaly analiz edildi. Gysgaça aýdylanda, 5μl metabolit ekstrakty HPLC (2 mm × 250 mm, bölejik ölçegi 4μm, Thermo Fisher Scientific) bilen enjamlaşdyrylan Dionex IonPac AS11-HC sütünine doldurma gatnaşygy 1 bolan bölekleýin aýlaw režiminde sanjyldy. ) Dionex IonPac AG11-HC gorag sütüni (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Sütüniň temperaturasy 30°C-de saklanýar we awtomatiki nusga alyjy 6°C-e goýulýar. Eluent generatory arkaly kaliý gidroksid gradientini döretmek üçin deionlaşdyrylan suw bilen üpjün edilen kaliý gidroksid kartrijini ulanyň. Metabolitleriň akym tizligi 380μl/min bolup, aşakdaky gradient ulanylýar: 0-dan 3 minuta çenli, 10 mM KOH; 3-den 12 minuta çenli, 10-dan 50 mM KOH; 12-den 19 minuta çenli, 50-den 100 mM KOH; 19-dan 21 minuta çenli, 100 mM KOH; 21-den 21,5 minuta çenli, 100-den 10 mM KOH. Kolonka 10 mM KOH-yň aşagynda 8,5 minutlap gaýtadan deňleşdirildi.
Elýusiýa edilen metabolitler sütünden soň 150μl/min izopropanol goşmaça akymy bilen birleşdirilýär we soňra negatiw ionlaşma režiminde işleýän ýokary çözgütli massa spektrometrine gönükdirilýär. MS m/z 50-den 750-ä çenli massa aralygyny 60,000 çözgüt bilen gözegçilik edýär. AGC 1×106-a sazlandy we iň ýokary ion wagty 100 ms-de saklanýar. Gyzdyrylan ESI çeşmesi 3,5 kV püskürme naprýaženiýesinde işledildi. Ion çeşmesiniň beýleki sazlamalary aşakdaky ýaly: kapillýar temperatura 275°C; örtük gaz akymy, 60 AU; kömekçi gaz akymy, 300°C-de 20 AU we S linza sazlamasy 60 AU.
13C belgili metabolitleriň maglumatlarynyň seljermesi. Izotop gatnaşygynyň maglumatlarynyň seljermesi üçin TraceFinder programma üpjünçiligini (4.2 wersiýasy, Thermo Fisher Scientific) ulanyň. Her bir birleşmäniň kimligi ygtybarly salgylanma birleşmesi bilen tassyklanyldy we garaşsyz seljerildi. Izotop baýlaşdyrmak seljermesini geçirmek üçin, her bir 13C izotopynyň (Mn) çykarylan ion hromatogrammasynyň (XIC) meýdany [M + H]+ -dan alyndy, bu ýerde n - aminokislotalary seljermek üçin ulanylýan maksatly birleşmäniň uglerod sany ýa-da [MH]+ - anionlary seljermek üçin ulanylýar. XIC-iň massa takyklygy millionda bäş bölekden az, RT-niň takyklygy bolsa 0,05 minut. Baýlaşdyrmak seljermesi her bir anyklanan izotopyň degişli birleşmäniň ähli izotoplarynyň jemine gatnaşygyny hasaplamak arkaly amala aşyrylýar. Bu gatnaşyklar her bir izotop üçin göterim gymmatlyklary hökmünde berilýär we netijeler öň beýan edilişi ýaly (42) molar göterim baýlaşdyrmak (MPE) hökmünde görkezilýär.
Doňdurylan neýron pellet buz ýaly sowuk 80% metanolda (g/g) gomogenleşdirildi, workes edildi we -20°C-da 30 minutlap inkubasiýa edildi. Nusgany ýene-de workesleň we +4°C-da 30 minutlap garyşdyryň. Nusga 21,000 g-da 4°C-da 5 minutlap santrifuga edildi, soňra emele gelen üstki gatlak ýygnaldy we soňraky analiz üçin 25°C-da SpeedVac konsentratory arkaly guradyldy. Ýokarda beýan edilişi ýaly, sortlanan öýjükleriň aminokislotalarynda LC-MS analizi geçirildi. TraceFinder (4.2 wersiýasy, Thermo Fisher Scientific) ulanyp, her bir birleşmäniň monoizotop massasyny ulanyp maglumat analizi geçirildi. Metabolit maglumatlarynyň kwantil normalizasiýa preprocessCore programma üpjünçiligi paketini (57) ulanyp geçirildi.
Dilim taýýarlamak. Syçana çaltlyk bilen uglerod dioksidi bilen anesteziýa berildi we kellesi kesildi, beýnisi çaltlyk bilen kelleden aýryldy we buz bilen doldurylan titreýän pyçak (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germaniýa) ony 300-den 375 μm-e çenli sagittal böleklere bölmek üçin ulanyldy. Sowuk uglerod gazlaşdyrmasy (95% O2 we 5% CO2) Pes Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glýukoza, 1.0 mM CaCl2 we 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 we 310-dan 330 mOsm-e çenli sazlaň). Alnan beýni böleklerini ýokary Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natriý fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glýukoza, 4.0 mM CaCl2 we mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 we 310-dan 320 mOsm-a çenli bolan kamera geçiriň. Bölümleri ýazga almazdan öň dikeltmek üçin 20-30 minut saklaň.
ýazgy. Ähli ýazgylar üçin berk ýazgy kamerasy we 20x suwa batyrmak üçin obýektiw linza (Scientifica) bilen enjamlaşdyrylan mikroskop basgançagy ulanyldy. Çaklanylýan Purkinje öýjükleri (i) beden ölçegleri, (ii) kiçi beýniniň anatomik ýerleşişi we (iii) fluorescent mtYFP reporter geniniň ekspresiýasy arkaly kesgitlendi. Ujunyň garşylygy 5-den 11 megohm-a çenli bolan ýama pipetkasy borosilikat aýna kapillýary (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germaniýa) we gorizontal pipetka Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA tarapyndan çekilýär. Ähli ýazgylar Signal programma üpjünçiligi (6.0 wersiýasy, Cambridge Electronic, Cambridge, Beýik Britaniýa) tarapyndan dolandyrylýan ELC-03XS npi ýama gysgyç güýçlendirijisi (npi electronic GmbH, Tam, Germaniýa) tarapyndan ýerine ýetirildi. Synag 12.5 kHz nusga alyş tizliginde ýazylyp alyndy. Signal degişlilikde 1,3 we 10 kHz kesiş ýygylyklary bolan iki gysga geçirijili Bessel süzgüçleri bilen süzülýär. Membrananyň we pipetkanyň sygymlylygy güýçlendirijini ulanyp kompensasiýa zynjyry arkaly kompensasiýa edilýär. Ähli tejribeler Hokawo programma üpjünçiligi (2.8 wersiýasy, Hamamatsu, Gerden, Germaniýa) tarapyndan dolandyrylýan Orca-Flash 4.0 kamerasynyň (Hamamatsu, Gerden, Germaniýa) gözegçiligi astynda geçirildi.
Adaty tutuş öýjük konfigurasiýasy we analizi. Ýazgydan derrew öň, pipetkany aşakdaky maddalary öz içine alýan içki ergin bilen dolduryň: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kaliý glýukonat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanozin trifosfat (GTP) (Na) we 10.0 mM kreatinin fosfat pH 7.25-e sazlandy we osmotik basyş 290 mOsm (saharoza) boldy. Membranany ýyrtmak üçin 0 pA güýç ulanylandan derrew soň, dynç alyş membranasynyň potensialy ölçeldi. Giriş garşylygy -40, -30, -20 we -10 pA giperpolýarlaşdyrylan toklary ulanmak arkaly ölçelýär. Naprýaženiýe jogabynyň ululygyny ölçeň we giriş garşylygyny hasaplamak üçin Om kanunyny ulanyň. Öz-özünden işjeňlik 5 minutlap naprýaženiýe gysgyjynda ýazylyp alyndy we sPSC ýarym awtomatiki tanamak skripti arkaly Igor Pro-da (32 7.01 wersiýasy, WaveMetrics, Leýk Oswego, Oregon, ABŞ) kesgitlenildi we ölçeldi. IV egri we durnukly ýagdaýdaky tok batareýany dürli potensiallarda (-110 mV-dan başlap) gysyp we naprýaženiýeni 5 mV ädimlerde artdyrmak arkaly ölçenýär. AP-niň öndürilişi depolýarizasiýa tokuny ulanmak arkaly synagdan geçirildi. Depolýarizasiýa tok impulsyny ulananyňyzda öýjük -70 mV-da gysyň. Her bir ýazgy birliginiň ädim ölçegini aýratynlykda sazlaň (10-dan 60 pA-a çenli). Iň ýokary AP ýygylygyna sebäp bolýan impuls çişlerini el bilen sanap, iň ýokary AP ýygylygyny hasaplaň. AP bosagasy bir ýa-da birnäçe AP-ni ilki başdan geçirýän depolýarizasiýa impulsynyň ikinji türewini ulanmak arkaly seljerilýär.
Deşikli ýama konfigurasiýasy we analizi. Standart protokollary ulanyp, deşikli ýama ýazgysyny ýerine ýetiriň. Aşakdaky maddalary öz içine almaýan ATP we GTP-siz pipetka ulanyň: 128 mM glýukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA we 2 mM MgCl2 we pH 7.2-e sazlaň (KOH ulanyp). Öýjük membranasynyň gözegçiliksiz geçirijiliginiň öňüni almak üçin ATP we GTP öýjük içi ergininden aýrylýar. Ýama pipetkasy amfoterisin saklaýan içki ergin (takmynan 200-250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) bilen doldurylýar, bu bolsa deşikli ýama ýazgysyny almak üçin ulanylýar. Amfoterisin dimetil sulfoksidde eredildi (soňky konsentrasiýa: 0.1-0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ulanylan DMSO-nyň konsentrasiýasy öwrenilýän neýronlara düýpli täsir etmedi. Deşik açyş prosesinde kanalyň garşylygy (Ra) yzygiderli gözegçilik edildi we Ra we AP amplitudasy durnuklaşandan soň (20-40 minut) synag başlandy. Özbaşdak işjeňlik 2-5 minutlap naprýaženiýe we/ýa-da tok gysgyjynda ölçenýär. Maglumat seljermesi Igor Pro (7.05.2 wersiýasy, WaveMetrics, ABŞ), Excel (2010 wersiýasy, Microsoft Corporation, Redmond, ABŞ) we GraphPad Prism (8.1.2 wersiýasy, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ulanylyp geçirildi. ABŞ). Özbaşdak AP-leri kesgitlemek üçin IgorPro-nyň NeuroMatic v3.0c plagini ulanylýar. Her bir ýazgy üçin aýratynlykda sazlanýan berlen bosaga ulanyp, AP-leri awtomatiki usulda kesgitleýär. Deşik aralygyny ulanyp, deşik ýygylygyny iň ýokary derrew deşik ýygylygy we ortaça deşik ýygylygy bilen kesgitläň.
PN izolýasiýasy. Öň çap edilen protokola uýgunlaşmak arkaly, PN-ler syçan beýnijiginden belli bir tapgyrda arassalandy (58). Gysgaça aýdylanda, beýnijig buz ýaly sowuk dissosasiýa gurşawynda [HBSS Ca2+ we Mg2+ bolmazdan, 20 mM glýukoza, penisillin (50 U/ml) we streptomisin (0,05 mg/ml) goşulan] bölünip alyndy we ownuklandy, soňra gurşaw papainde siňdirildi [HBSS, 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) we deoksiribonukleaza I (DNase I; 0,1 mg/ml) goşulan] 30°C-da 30 minutlap bejerildi. Ilki bilen dokumalary ýumurtga çişmesini (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) we DNase (0.1 mg/ml) saklaýan HBSS gurşawynda fermentatiw siňdirişiň öňüni almak üçin otag temperaturasynda ýuwuň, soňra 20 mM glýukoza saklaýan HBSS gurşawynda HBSS-de ýuwaşlyk bilen üwemek, penisillin (50 U/ml), streptomisin (0.05 mg/ml) we DNase (0.1 mg/ml) ýeke öýjükleri çykarýar. Netijede dörän öýjük suspenziýasy 70 μm öýjük süzgüçden süzüldi, soňra öýjükler santrifugalamak arkaly (1110 aýlaw/minut, 5 minut, 4°C) pelletlendi we sortlaýjy gurşawda gaýtadan suspenzasiýa edildi [HBSS, 20 mM glýukoza, 20% fetal sygyr syworotkasy bilen goşuldy) syworotka, penisillin (50 U/ml) we streptomisin (0.05 mg/ml)]; öýjükleriň ýaşaýyş ukybyny propidium ýodidi bilen bahalaň we öýjükleriň dykyzlygyny 1 × 106-dan 2 × 106 öýjük/ml-e çenli sazlaň. Akym sitometriýasyndan öň, suspenziýa 50 μm öýjük süzgüçden süzüldi.
Akym sitometri. Öýjükleri sortlamak 4°C-de FACSAria III enjamy (BD Biosciences) we FACSDiva programma üpjünçiligi (BD Biosciences, 8.0.1 wersiýasy) ulanylyp geçirildi. Öýjük suspenziýasy 100 μm burun arkaly 20 psi basyş astynda ~2800 waka/sek tizlikde sortlandy. Adaty derweze ölçegleri (öýjük ölçegi, bimodal tapawutlandyrmak we saçramagyň häsiýetnamalary) PN-niň beýleki öýjük görnüşlerinden dogry izolýasiýasyny üpjün edip bilmeýändigi üçin, derweze strategiýasy mitoYFP+ ​​​​we gözegçilik mitoYFP − Syçanlarynda YFP intensiwliginiň we awtofluoresensiýasynyň gönüden-göni deňeşdirilmegine esaslanyp kesgitlenýär. YFP nusgany 488 nm lazer liniýasy bilen şöhlelendirmek arkaly oýandyrylýar we signal 530/30 nm zolakly geçiriji süzgüç arkaly anyklanýar. mitoYFP+ ​​syçanlarynda Rosa26-mitoYFP reporter geniniň deňeşdirme güýji neýron bedenini we akson böleklerini tapawutlandyrmak üçin hem ulanylýar. 7-AAD 561 nm sary lazer bilen gyjyndyrylýar we öli öýjükleri aýyrmak üçin 675/20 nm zolak geçirijilik filtri bilen anyklanýar. Şol bir wagtyň özünde astrositleri aýyrmak üçin öýjük suspenziýasy ACSA-2-APC bilen boýaldy, soňra nusga 640 nm lazer liniýasy bilen şöhlelendirildi we signaly anyklamak üçin 660/20 nm zolak geçirijilik filtri ulanyldy.
Ýygnalan öýjükler santrifuga arkaly (1110 aýlanyş/minut, 5 minut, 4°C) bölünip, ulanylýança -80°C temperaturada saklandy. Prosedura üýtgeşikligini azaltmak üçin Mfn2cKO syçanlary we olaryň çagajyklary şol bir günde klassifikasiýa edilýär. FACS maglumatlarynyň görkezilişi we seljermesi FlowJo programma üpjünçiligi (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, ABŞ) arkaly geçirildi.
Ýokarda agzalyp geçilişi ýaly (59), real wagt PCR, soňraky mtDNK mukdaryny kesgitlemek üçin tertiplenen neýronlardan DNK-ny bölüp almak üçin ulanylýar. Lineýerlik we bosaga duýgurlygy ilki dürli sanly öýjüklerde qPCR geçirmek arkaly synagdan geçirildi. Gysgaça aýdylanda, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 we proteinaza K (200 ng/ml)-den ybarat lizis buferinde 300 PN ýygnaň we 55°C-da 120 minut inkubasiýa ediň. Proteinaza K-nyň doly işjeňsizleşdirilmegini üpjün etmek üçin öýjükler 95°C-da 10 minutlap mundan beýläk inkubasiýa edildi. mt-Nd1-e mahsus TaqMan zondyny (Thermo Fisher) ulanyp, mtDNK 7900HT real wagt PCR ulgamynda (Thermo Fisher Scientific) ýarym sanly PCR arkaly ölçeldi. Science, katalog belgisi Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalog belgisi AIVI3E8) we 18S (Thermo Fisher Scientific, katalog belgisi Hs99999901_s1) genleri.
Proteom nusgasyny taýýarlamak. Ergini 95°C-da 10 minutlap gyzdyryp we ultrases bilen lizis buferinde [6 M guanidin hlorid, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin gidrohlorid, 10 mM hloroasetamid we 100 mM tris- HCl-de doňan neýron granulalaryny lizis edýär]. Bioruptorda (Diagenode) 10 minutlap (30 sekunt impuls / 30 sekunt arakesme döwri) geçirildi. Nusga 20 mM tris-HCl-de (pH 8.0) 1:10 suwlandyryldy, 300 ng tripsin altyny (Promega) bilen garyşdyryldy we doly siňdiriş gazanmak üçin 37°C-de bir gije inkubasiýa edildi. Ikinji günde nusga 20,000 g-da 20 minutlap santrifuga edildi. Üstki gatlak 0.1% formik kislota bilen suwlandyryldy we ergin öz-özünden ýasalan StageTips bilen duzsuzlaşdyryldy. Nusga SpeedVac guralynda (Eppendorf konsentratori plus 5305) 45°C-da guradyldy, soňra peptid 0,1% formik kislotada suspenziýa edildi. Ähli nusgalar bir adam tarapyndan bir wagtda taýýarlanyldy. Astrosit nusgalaryny seljermek üçin, 4 mkg duzsuzlaşdyrylan peptidler peptid-TMT reagent gatnaşygy 1:20 bolan tandem massa etiketkasy (TMT10plex, katalog belgisi 90110, Thermo Fisher Scientific) bilen etiketlendi. TMT etiketkasy üçin 0,8 mg TMT reagent 70 μl suwsuz ACN-de gaýtadan suspenziýa edildi we guradylan peptid 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat) görnüşinde gaýtadan düzüldi, oňa ACN-däki 7 μl TMT reagent goşuldy. Konsentrasiýasy 43,75% boldy. 60 minut inkubasiýadan soň, reaksiýa 2 μl 5% gidroksilamin bilen söndürildi. Belliklenen peptidler ýygnaldy, guradyldy, 200 μl 0,1% formik kislotada (FA) gaýtadan suspenziýa edildi, iki bölege bölündi we soňra öz-özünden ýasalan StageTips arkaly duzsuzlaşdyryldy. UltiMate 3000 ultra ýokary öndürijilikli suwuk hromatografyny (UltiMate 3000 ultra ýokary öndürijilikli suwuk hromatograf) ulanyp, iki ýarymyň biri 130Å1.7μm C18 bölejikleri bilen doldurylan 1mm x 150mm Acquity hromatografiki sütüninde fraksiýa edildi (Waters, katalog № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptidleri 30μl/min akym tizliginde aýryň, 1% -den 50% -e çenli bufer B-den 85 minutlap 96 minutlyk basgançak gradient bilen aýryň, 50% -den 95% -e çenli bufer B-den 3 minutlap, soňra 95% bufer B üçin 8 minutlap aýryň; A buferi 5% ACN we 10 mM ammonium bikarbonatdan (ABC), B buferi bolsa 80% ACN we 10 mM ABC-den ybarat. Her 3 minutda fraksiýalary ýygnaň we olary iki topara (1 + 17, 2 + 18 we ş.m.) birleşdiriň we wakuum santrifugasynda guradyň.
LC-MS/MS analizi. Mass spektrometriýasy üçin peptidler (r119.aq belgili) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ serişdesi (Dr. Maisch, mat) bilen enjamlaşdyrylan 25 sm, 75 μm içki diametri bolan PicoFrit analitik sütuninde (täze obýektiw linza, bölek belgisi PF7508250) bölündi, Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germaniýa). Sütun 50°C-de saklandy. A we B buferleri degişlilikde suwda 0.1% formik kislotadan we 80% ACN-de 0.1% formik kislotadan ybarat. Peptidler 6% -den 31% -e çenli B buferinden 65 minut we 31% -den 50% -e çenli B buferinden 5 minut 200 nl/min gradient bilen bölündi. Elýutirlenen peptidler Orbitrap Fusion massa spektrometrinde (Thermo Fisher Scientific) seljerildi. Peptid prekursorynyň m/z ölçegi 350-den 1500 m/z aralygynda 120,000 çözgüt bilen ýerine ýetirildi. 27% normallaşdyrylan çaknyşyk energiýasyny ulanyp, ýokary energiýaly C duzak dissosiasiýa (HCD) bölünmesi üçin 2-den 6-a çenli zarýad ýagdaýy bolan iň güýçli prekursor saýlanyldy. Sikl wagty 1 s-e kesgitlendi. Peptid böleginiň m/z gymmaty ion duzagynda iň kiçi AGC nyşany 5×104 we iň ýokary inýeksiýa wagty 86 ms ulanylyp ölçeldi. Parçalanandan soň, prekursor 45 s üçin dinamiki çykarylma sanawyna girizildi. TMT bilen belgilenen peptidler 50 sm, 75 μm Acclaim PepMap sütuninde (Thermo Fisher Scientific, katalog belgisi 164942) bölündi we migrasiýa spektrleri ýokary meýdanly assimetrik tolkun görnüşi ionlary (FAIMS) enjamlary (Thermo Fisher Scientific) bilen enjamlaşdyrylan Orbitrap Lumos Tribrid massa spektrometrinde (Thermo Fisher Scientific) seljerildi, ol −50 we −70 V iki kompensasiýa naprýaženiýesinde işleýär. Sinhronizasiýa prekursoryna esaslanyp saýlanan MS3 TMT hasabatynyň ion signalyny ölçemek üçin ulanylýar. Peptid bölünişi EASY-nLC 1200-de, 90% çyzykly gradient elýusiýasy ulanylyp, bufer konsentrasiýasy 6%-den 31%-e çenli boldy; A buferi 0,1% FA, B buferi bolsa 0,1% FA we 80% ACN boldy. Analitik sütun 50°C-de işleýär. FAIMS kompensasiýa naprýaženiýesine görä asyl faýly bölmek üçin FreeStyle (1.6 wersiýasy, Thermo Fisher Scientific) ulanyň.
Beloklary kesgitlemek we mukdaryny kesgitlemek. Integrasiýa edilen Andromeda gözleg motoryny ulanyp, asyl maglumatlar MaxQuant 1.5.2.8 wersiýasyny ulanyp seljerildi (https://maxquant.org/). Aequorea victoria-dan alnan Cre rekombinaza we YFP yzygiderliklerinden başga-da, peptid fragment spektrlerinde syçan salgylanma proteomynyň (Proteome ID UP000000589, 2017-nji ýylyň maý aýynda UniProt-dan göçürilip alyndy) kanonik yzygiderliligi we izoform yzygiderliligi gözlenildi. Metionin oksidlenmesi we belogyň N-terminal asetilleşmesi üýtgeýän üýtgeşmeler hökmünde bellenildi; sistein karbamoil metilleşmesi üýtgeýän üýtgeşmeler hökmünde bellenildi. Hazym parametrleri "spesifiklik" we "tripsin/P" hökmünde bellenildi. Beloklary kesgitlemek üçin ulanylýan peptidleriň we ülgüç peptidleriniň iň az sany 1; özboluşly peptidleriň iň az sany 0. Peptid kartasynyň gabat gelmegi şertlerinde belogyň kesgitlenme tizligi 0,01 boldy. "Ikinji peptid" opsiýasy işjeňleşdirildi. Dürli asyl faýllaryň arasynda üstünlikli identifikasiýalary geçirmek üçin "işleriň arasyndaky gabat gelme" opsiýasyny ulanyň. Etiketsiz mukdary kesgitlemek (LFQ) üçin LFQ minimal gatnaşygynyň sany 1-i ulanyň (60). LFQ intensiwligi her wagt nokadynda azyndan bir genotip toparynda azyndan iki ygtybarly gymmatlyk üçin süzülýär we 0.3 giňligi we 1.8 aşak hereket edýän normal paýlanyşdan ekstrapolýasiýa edilýär. LFQ netijelerini seljermek üçin Perseus hasaplaýyş platformasyny (https://maxquant.net/perseus/) we R (https://r-project.org/) ulanyň. Differensial ekspresiýa seljermesi üçin limma programma üpjünçiliginden iki taraplaýyn orta t synag ulanyldy (61). Gözleg maglumatlarynyň seljermesi ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally we pheatmap ulanylyp ýerine ýetirilýär. TMT esasyndaky proteomika maglumatlary MaxQuant wersiýasynyň 1.6.10.43 ulanylyp seljerildi. 2018-nji ýylyň sentýabr aýynda göçürip alnan UniProt-yň adam proteomikasy maglumat bazasyndan çig proteomika maglumatlaryny gözläň. Analiz öndüriji tarapyndan berlen izotop arassalygynyň düzediş faktoryny öz içine alýar. Differensial ekspresiýa analizi üçin R-de limma ulanyň. Asyl maglumatlar, maglumat bazasynyň gözleg netijeleri we maglumat analiziniň iş akymy we netijeleri PRIDE hyzmatdaş repozitoriýasy arkaly ProteomeXchange bileleşiginde maglumat toplumy identifikatory PXD019690 bilen saklanýar.
Funksional düşündirişler seljermäni baýlaşdyrýar. 8 hepdelik maglumatlar toplumynyň funksional düşündiriş şertleriniň baýlygyny kesgitlemek üçin Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) guraly ulanyldy (1-nji surat). Gysgaça aýdylanda, LC-MS/MS (tandem massa spektrometriýasy) maglumat seljermesinden alnan mukdar belok sanawy aşakdaky süzgüç kriteriýalary bilen ulanylýar: Mus musculus görnüş we fon hökmünde saýlanýar we kategoriýada Benjamininiň 0,05 ýa-da ondan pes baýlaşdyrmak üçin düzedilen P gymmaty möhüm hasaplanýar. Bu grafik üçin, düzedilen P gymmatyna esaslanýan her bir klasterdäki iň gowy bäş artykmaç kategoriýa görkezilýär. Benjamininiň, Kriegeriň we Ýekutieliniň (Q = 5%) iki tapgyrly çyzykly güýçlendirme programmasyny ulanyp, köp sanly t-test ulanylyp, her bir kategoriýada kesgitlenen möhüm dalaşgärler boýunça wagt boýunça belok ekspresiýasy seljermesi geçirilýär we her setir aýratynlykda seljerilýär. Yzygiderli SD kabul etmegiň zerurlygy ýok.
Bu gözlegiň netijelerini çap edilen maglumat bazalary bilen deňeşdirmek we 1-nji suratda Venn diagrammasyny döretmek üçin, biz mukdar taýdan belok sanawyny MitoCarta 2.0 annotasiýalary bilen birleşdirdik (24). Diagrammany döretmek üçin Draw Venn Diagram onlaýn guralyny (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ulanyň.
Proteomika seljermesi üçin ulanylýan statistiki usullar barada jikme-jik maglumat üçin, "Materiallar we usullar" bölümine serediň. Beýleki ähli tejribeler üçin jikme-jik maglumatlary degişli rowaýatda tapyp bolýar. Başgaça görkezilmedik bolsa, ähli maglumatlar ortaça ± SEM hökmünde görkezilýär we ähli statistiki seljermeler GraphPad Prism 8.1.2 programma üpjünçiligi arkaly geçirildi.
Bu makala üçin goşmaça materiallar üçin http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 salgysyna serediň.
Bu Creative Commons Attribution-Non-Commercial License şertlerine laýyklykda ýaýradylýan açyk girişli makala bolup, ol islendik serişdede ulanmaga, ýaýratmaga we köpeltmäge rugsat berýär, eger soňky ulanyş täjirçilik girdejisi üçin bolmasa we asyl işiň dogrudygy şerti bilen. Salgylanma.
Bellik: Sahypa maslahat berýän adamyň e-poçtany görmegini isleýändigiňizi we onuň spam däldigini bilmegi üçin diňe e-poçta salgyňyzy bermegiňizi haýyş edýäris. Biz hiç hili e-poçta salgylaryny hasaba almarys.
Bu sorag siziň myhmandygyňyzy barlamak we awtomatiki spam iberilmeginiň öňüni almak üçin ulanylýar.
E. Motori, I. Atanassow, SMV Koçan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunksiýaly neýronlaryň proteomika seljermesi metabolik programmalaryň neýrodegenerasiýa garşy durmak üçin işjeňleşdirilýändigini görkezdi.
E. Motori, I. Atanassow, SMV Koçan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunksiýaly neýronlaryň proteomika seljermesi metabolik programmalaryň neýrodegenerasiýa garşy durmak üçin işjeňleşdirilýändigini görkezdi.
© 2020 Ylmyň ösüşi üçin Amerikan birleşigi. ähli hukuklar goralandyr. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef we COUNTER-iň hyzmatdaşy. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.