Häzirki†Häzirki salgysy: OX11 0DE, Beýik Britaniýa, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Beýik Britaniýa, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektron Biologiki Surat Merkezi.
Reaksiýa merkeziniň ýagtylyk ýygnaýjy kompleksi 1 (RC-LH1) gyrmyzy fototrofik bakteriýalaryň esasy fotosintez komponentidir. Biz Rhodopseudomonas palustris-den RC-LH1 toplumynyň iki krio-elektron mikroskopiýa gurluşyny girizdik. RC-LH114-W toplumynyň 2.65-Å çözgüt gurluşy RC-ni gurşap alýan 14 kiçi birlik LH1 halkalaryndan ybarat bolup, ol belok W bilen kesilýär, belok-W-siz kompleks bolsa doly RC düzümi bilen gurşalan. Ýapyk 16 kiçi birlik LH1 halkasy. Bu gurluşlaryň deňeşdirilmegi RC-LH1 toplumyndaky hinon dinamikasyna, şol sanda RC QB ýerinde hinon bilen baglanyşda öň kesgitlenmedik konformasiýa üýtgeşmelerine, şeýle hem olaryň RC-e geçmegine kömek edýän kömekçi hinon baglanyş ýerleriniň ýerleşýän ýerine düşünmäge mümkinçilik berýär. W belogynyň özboluşly gurluşy LH1 halkasynyň ýapylmagynyň öňüni alýar, şeýdip hinon/hinolon alyş-çalşygyny çaltlaşdyrmak üçin kanal döredýär.
Fotosintez arkaly berilýän energiýa ýer ýüzündäki ähli ýaşaýyşy diýen ýaly saklap bilýär we gün biotehnologiýasy üçin uly mümkinçiliklere eýedir. Global fotosintezi ösdürmek bilen birlikde, gyrmyzy fototrofik bakteriýalar dürli energiýa usullaryny we metabolik ukyplary hem görkezýärler. Olar fotosintezden gaça durup, garaňkyda geterotrofik bakteriýalar hökmünde ösüp bilýärler, azoty we uglerod dioksidini berkidip bilýärler, wodorod öndürip bilýärler we aromatik birleşmeleri dargadyp bilýärler (1-3). Bu prosesler üçin energiýa bermek üçin ýagtylyk çalt we netijeli himiki energiýa öwrülmelidir. Bu proses ýagtylygy tutýan antenna toplumy ýagtylygy özüne siňdirip, tutulan energiýany reaksiýa merkezine (RC) geçirýän wagty başlaýar we şeýdip zarýad bölünişi başlaýar (4-7). Gyrmyzy fototrofik bakteriýalarda fotosinteziň esasy birligi 2-nji görnüşli RC-den ybarat bolup, onuň töwereginde ýagtylygy ýygnaýjy 1-nji kompleks (LH1) bar we RC-LH1 esasy kompleksini emele getirýär. LH1 egri αβ geterodimerleriniň massiwi bilen emele gelýär, olaryň her biri iki bakteriýa hlorofill (BChl) a molekulasyny we bir ýa-da iki karotinoidi (8-12) baglanyşdyrýar. Iň ýönekeý LH1 antennasy RC-ni (9-13) ýapyk aýlawda gurşap alýan 16 ýa-da 17 αβ geterodimerden ybarat, ýöne beýleki esasy komplekslerde transmembran peptidleri töweregindäki LH1-iň dowamlylygyny bozýar we şeýdip RC bilen sitohrom bc1 toplumynyň arasyndaky hinol/hinon diffuziýasyny höweslendirýär (11, 13-15). Gyrmyzy fototrofik ösümlik Rhodopseudomonas (Rps.) fotosintezi goldaýan energiýany we elektron geçişini düşünip bilýän model organizmdir. Rps-iň ilkinji kristal gurluşy. Palustris RC-LH1 toplumynyň modeli RC bolup, 15 geterodimerik LH1 aýlawlary bilen gurşalan, olar "Protein W" atly näbelli belok tarapyndan kesilýär (14). Protein-W soňra RPA4402 hökmünde kesgitlendi, bu bolsa üç sany çaklanylýan transmembran spirallary (TMH) bolan häsiýetsiz 10,5 kDa belokdyr (16). Biz RC-L, M (pufL, pufM) we LH1α, β (pufA, pufB) kiçi birliklerini kodlaýan genler üçin ulanylýan nomenklatura bilen gabat gelmek üçin W belogyny kodlaýan rpa4402 geniniň adyny pufW diýip üýtgetmegi teklip edýäris. Gyzykly tarapy, W belogy RC-LH1-iň diňe 10% -inde bar, bu bolsa Rps. palustris-iň iki dürli RC-LH1 kompleksini öndürýändigini görkezýär. Bu ýerde biz iki esasy kompleksiň, biri W belogy we 14 αβ geterodimerli, beýlekisi W belogy we ýapyk 16 Heterodimer LH1 halkasy bolmadyk ýokary çözgütli krio-EM (krio-EM) gurluşlaryny habar berýäris. Biziň gurluşymyz Rps. palustris-iň RC-LH1 kompleksini düşünmekde basgançak üýtgeşmäni görkezýär, sebäbi biz her bir wariandyň birmeňzeş populýasiýasyny seljerdik we her bir peptid we baglanyşykly pigmentleri hem-de degişli lipidleri we hinonlary aýdyň kesgitlemek üçin ýeterlik çözgütlere eýe. Bu gurluşlaryň deňeşdirilmegi, şu wagta çenli başga hiç bir RC-LH1 toplumynda tapylmadyk üç TMH belok-W-nyň hinon/hinolon alyş-çalşygyny çaltlaşdyrmak üçin hinon kanalyny döredýändigini görkezýär. Birnäçe saklanan lipid we hinon baglanyş ýerleri anyklandy we biz hinon we RC-niň utgaşmasyndan soň täze konformasiýa üýtgeşmesini ýüze çykardyk, bu bolsa kislorodly fototrof organizmleriň fotosistema II (PSII) RC üçin amatly bolup biler. Biziň netijelerimiz gyrmyzy fototrofik bakteriýalaryň RC-LH1 esasy toplumynda hinon/hinolon baglanyşynyň we alyş-çalşygynyň kinetikasy barada täze düşünjeleri berýär.
Rps. palustris-de tapylan iki kompleksiň jikme-jik öwrenilmegini ýeňilleşdirmek üçin, her bir RC-LH1-i biohimiki usullar bilen bölüp alýarys. W-ýetmezçilikli kompleks (mundan beýläk ΔpufW diýlip atlandyrylýar) pufW geniniň ýok ştammyndan arassalandy (16) we diňe bir RC-LH1 kompleksi öndürilip bilner. W-belokly kompleks ştamm tarapyndan öndürilýär. Bu ştammyň W belogy C-terminalynda 10x His teg bilen üýtgedilip, W-belokly kompleks metaly hereketsizleşdirmek arkaly köp ýetmezçilikli W belokly bilen netijeli birleşdirilip bilner. Kompleks netijeli bölünýär (16) Affinity Hromatografiýasy (IMAC).
1-nji suratda görkezilişi ýaly, iki toplum hem LH1 antennasy bilen gurşalan üç kiçi birlik RC (RC-L, RC-M we RC-H) öz içine alýar. Belok-W ýetmeýän toplumyň 2.80-A gurluşy 16 αβ geterodimeri görkezýär, olar RC-ni doly gurşap alýan ýapyk LH1 halkasyny emele getirýär, mundan beýläk RC-LH116 toplumy diýlip atlandyrylýar. Belok-W saklaýan toplumyň 2.65Å gurluşynda belok-W tarapyndan kesilen 14-geterodimer LH1 bar, mundan beýläk RC-LH114-W diýlip atlandyrylýar.
(A we B) Birleşmäniň ýüzleý görkezilişi. (C we D) Çubuklarda beýan edilen baglanyşykly pigmentler. (E we F) Sitoplazmatik ýüzünden synlanan kompleksler multfilmlerde görkezilen peptidlere we LH1 kiçi birliklerine eýedir we belok-W aralygyndan sagat ugruna nomerlenýär [Rba nomerlemesine laýyk gelýär. sphaeroides kompleksi (13)]. LH1-α üçin belok kiçi birliginiň reňki sary; LH1-β üçin belok kiçi birliginiň reňki gök; belok-W üçin belok gyzyl; RC-H üçin gök reňk; RC-L üçin Mämişi reňk; RC-M üçin gyrmyzy reňk. Kofaktorlar çybyklar bilen, ýaşyl BChl we BPh a molekulalaryny, gyrmyzy karotinoidleri we sary UQ10 molekulalaryny aňladýar. (G we H) RC-LH114-W toplumynyň (G) we RC-LH116 toplumynyň (H) deň sebitinde belok-W aralygynyň ulaldylan görnüşi. Kofaktorlar boşlugy doldurmak görnüşinde görkezilýär, helatlanan hinon gök reňkde görkezilýär. Belok-W aralygy (G)-de gök reňkli punktir çyzyk bilen, hinon/hinololyň LH116 halkasynda ýaýraýan kiçi deşikler bolsa (H)-de gara punktir çyzyk bilen görkezilýär.
1-nji suratda (A we B) her biri iki BChl we bir karotenoid bilen baglanyşýan açyk ýa-da ýapyk LH1αβ geterodimerleriniň massiwleri bilen gurşalan RC görkezilýär (1-nji surat, C we D). Öňki barlaglar Rps-iň LH1 kompleksidigini görkezdi. Spirulina ksantiniň biosintez ýolunda bu görnüşler karotenoidleriň garyşyk populýasiýalaryny öz içine alýar (17). Şeýle-de bolsa, spiropirroksantin dominant karotenoiddir we onuň dykyzlygy kanagatlanarlydyr. Şonuň üçin biz spiroksantiniň ähli LH1 baglanyş ýerlerinde modelleşdirilmegini saýladyk. Alfa we beta polipeptidleri gysga membranaly daşky sebitleri bolan ýeke-täk TMH-lerdir (1-nji surat, A, B, E we F). C-terminalynda 17 galyndylaryň dykyzlygy syn edilmese-de, alfa polipeptid iki kompleksde hem Met1-den Ala46-a bölündi. RC-LH116-da β polipeptidi Gly4-den Tyr52-ä, RC-LH114-W-da bolsa Ser5-den Tyr52-ä çenli azaldy. 3 ýa-da 4 N-terminal ýa-da 13 C-terminal galyndylarynyň dykyzlygy syn edilmedi (S1-nji surat). Ýabany görnüşli ştammdan taýýarlanan garyşyk RC-LH1 toplumynyň massa spektrometriýa seljermesi ýitirilen sebitiň bu peptidleriň geterologik bölünmeginiň netijesidigini görkezdi (S1 we S2-nji surat). α-Met1-iň N-terminal formilleşdirilmegi hem syn edildi (f). Seljerme α-peptidiň fMet1-den Asp42/Ala46/Ala47/Ala50-e çenli galyndylaryndan, β-peptid bolsa Ser2-den Ala53-e çenli galyndylaryndan ybaratdygyny görkezdi, bu bolsa pes temperatura EM dykyzlyk kartasy bilen gowy gabat gelýär.
α-His29 we β-His36-nyň koordinasiýa edilmegi BChl-leri ýüzbe-ýüz edýär; her bir αβ geterodimer goňşulary bilen birleşip, RC-niň daşynda açyk halka (RC-LH114-W) ýa-da ýapyk halka (RC-LH116) emele getirýär. Eksiton baglanyşykly pigment massiwi (1-nji surat, C we D). RC-LH114-W-niň 877 nm zolagy bilen deňeşdirilende, RC-LH116-nyň 880 nm siňdiriş gyzyl süýşmesi 3 nm-e deňdir (2A surat). Şeýle-de bolsa, tegelek dihroizm spektri diýen ýaly birmeňzeşdir (2B surat), bu açyk we ýapyk halkalaryň arasynda aýdyň tapawut bar bolsa-da, BChl-leriň ýerli gurşawynyň örän meňzeşdigini görkezýär. Siňdiriş gyzyl süýşmesi ýapyk halkada termal hereketiň peselmeginiň we durnuklylygyň ýokarlanmagynyň (18, 19), ýapyk halka sebäpli pigment birikmesiniň üýtgemeginiň (20, 21) ýa-da bu iki täsiriň utgaşmasynyň (11) netijesi bolup biler.
(A) Ultrafiolet/görünýän/ýakyn infragyzyl siňdiriş spektri, onuň depeleri degişli pigmentler bilen bellenilýär we 775 nm-de BPh depesine kadalaşdyrylýar. (B) 805 nm-de BChl siňdirişine kadalaşdyrylýan tegelek dihroizm spektri. (C we D) RC-LH114-W toplumynyň (C) we RC-LH116 toplumynyň (D) wagt boýunça çözülen siňdiriş spektrlerinden saýlanan ΔA spektrleri. Has gowy deňeşdirmek üçin, ähli spektrler 0,2 ps-de −A-nyň ∆A-syna kadalaşdyrylýar. (E) UQ2-niň dürli konsentrasiýalarynyň gatnaşmagynda şöhlelendirmeden soň sitohrom c2 oksidlenme tizligi (çig maglumatlar üçin S8 suratyna serediň). (F) Pes, orta ýa-da ýokary intensiwlikli ýagtylykda ösdürilen öýjüklerde (degişlilikde 10, 30 ýa-da 300μMm-2 s-1), arassalanan toplumdaky W we RC-L kiçi birlikleri we bölünen membrana gatnaşygy. SDS-poliakrilamid gel elektroforezi we immunoanaliz arkaly belok derejesini kesgitläň (çig maglumatlar üçin S9-njy surata serediň). Arassalanan RC-LH114-W toplumyna gatnaşygy kesgitläň. Kompleksiň RC-L-iň belok-W-a stehiometrik gatnaşygy 1:1-e deňdir.
RC-LH114-W-niň deformasiýa edilen αβ14 halkasyndaky 1-nji pozisiýadaky BChl-ler (1-nji surat, A, C we E) RC-LH116-daky deň BChl-lerden RC esasy donoryna (P) 6.8Å ýakyn (1-nji surat, B, D we F, we S3-nji surat); ýöne, iki kompleksiň geçiş siňdiriş kinetikasy RC-LH114-W we RC-LH116 üçin LH1-den RC-e gyjyndyryş energiýasynyň geçiş wagtynyň sabitleriniň 40 ±4 we 44±3 ps bolandygyny görkezýär (2-nji surat). , C we D, S4-nji surat we S2-nji tablisa). RC-niň içinde elektron geçişde hem düýpli tapawut ýok (S5-nji surat we degişli goşmaça tekst). LH1 we RC-P arasyndaky energiýa geçiş wagtynyň ýakyn gabat gelmeginiň iki LH1 halkasyndaky köp BChl-iň meňzeş aralygy, burçy we potensial energiýasy bilen baglanyşyklydygyna şübhelenýäris. Minimal aralyga ýetmek üçin LH1 energiýa nusgasyny öwrenmek, suboptimal ýerlerden RC-e göni energiýa geçirmekden has çalt däl ýaly. RC-LH114-W-däki açyk aýlawly LH1 aýlawy, gurluş seljermesi üçin pes temperatura şertlerinde hem ähmiýetsiz termal herekete sezewar bolup biler we RC 1 pozisiýasyndaky βBChls-iň pigmentasiýa aralygyndan otagyň temperaturasynda has uzyn αβ14 halka konformasiýasy bar.
RC-LH116 kompleksi 32 BChl we 16 karotinoidden ybarat we onuň umumy gurluşy Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Belok Maglumat Banky (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 ştammyndan (PDB ID 7C9R) (12) we ýaşyl suw otlaryndan (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) alnan düzüm bilen birmeňzeşdir. Deňleşdirilenden soň, αβ geterodimerleriniň, esasanam 1-5, 15 we 16-nyň ýerleşýän ýerlerinde diňe kiçi üýtgeşiklikler syn edildi (S6 surat). Belok-W-nyň bolmagy LH1-iň gurluşyna uly täsir edýär. Onuň üç TMH-si gysga halkalar arkaly baglanyşykly, N-terminaly kompleksiň lümen tarapynda we C-terminaly sitoplazmatik tarapynda (1A we 3 suratlar, A-dan D-ä çenli). Belok-W esasan gidrofob (3B surat) we TMH2 we TMH3 transmembran ýüzüni emele getirmek üçin LH1αβ-14 bilen özara täsirleşýär (3-nji surat, B we E-den G-ä çenli). Serhet esasan transmembran sebitinde Phe, Leu we Val galyndylaryndan ybarat. Bu galyndylaryň gidrofob aminokislotalary we αβ-14 pigmentleri bilen örtülen. Käbir polýar galyndylary hem özara täsirleşmä goşant goşýar, şol sanda kompleks boşlugyň ýüzünde W-Thr68 bilen β-Trp42 arasyndaky wodorod baglanyşygy (3-nji surat, F we G). Sitoplazmanyň ýüzünde Gln34 αβ-14 karotinoidleriniň keto toparyna golaý. Mundan başga-da, n-dodesil β-d-maltozid (β-DDM) molekulasy çözüldi we onuň gidrofob guýrugy belok-W bilen αβ-14 arasyndaky serhede çenli uzaldy we lipid guýrugy bedende ýerleşip biler. Şeýle hem, W beloklynyň we RCH-nyň C-terminal çözünürlük sebitleriniň örän ýakyn, ýöne belli bir özara täsirleri emele getirmegiň çäginde däldigini gördük (1-nji surat, A we E). Şeýle-de bolsa, bu iki belokyň çözülmedik C-terminal aminokislotalarynda özara täsirler bolup biler, bu bolsa RC-LH114-W toplumynyň ýygnalmagy wagtynda protein-W-niň işe alynmagy üçin mehanizm döredip biler.
(A) LH1αβ14 bilen serhete multfilm görnüşinde seredýän Belok-W-nyň elektrostatik potensial diagrammasynyň bir böleginde görkezilen taýak şekilli gapdal zynjyry (gyzyl) bar (kontur derejesi 0,13 bolan açyk çal reňkli ýüz). (B) Belok-W gidrofob reňkli ýüz bilen görkezilýär. Polýar we zarýadly ýerler gök reňkde, gidrofob ýerler ak reňkde, güýçli gidrofob ýerler bolsa mämişi reňkde görkezilýär. (C we D) Belok-W multfilmde görkezilýär, onuň ugry (A) (C) bilen birmeňzeş we 180° (D) aýlanýar. Yzygiderlilikdäki pozisiýa görä, tapawutlandyryp bolýan galyndylar gökguşak reňk shemasyny kabul edýär, bu ýerde N-ujy gök we C-ujy gyzyl reňkde. (E) Belok-W (A) bilen birmeňzeş görnüşde we belok-W:LH1 serhetindäki galyndylar birikdirilen belgileri bolan taýaklar bilen görkezilýär. (F) Belok-W multfilm görnüşinde (E) we LH1αβ14-e, şeýle hem sütun görnüşinde serhet galyndylaryna görä 90° öwrülýär. Beta polipeptidinden asylýan galyndylaryň ady belliklenýär. Kofaktor 1-nji şekiliň reňkine laýyk gelýän sütun hökmünde görkezilýär, parçalanan β-DDM çal reňkde, kislorod bolsa gyzyl reňkde görkezilýär. (G) (F)-däki görnüş 180° öwrülýär, ady belli alfa polipeptidiniň görnükli galyndylary bilen.
Protein-W αβ geterodimeriniň (1F suratdaky 15-nji) ornuny tutýar, şeýlelik bilen halkanyň ýapylmagynyň we ilkinji üç αβ geterodimeriniň egilmeginiň öňüni alýar. Birinji αβ-1 geterodimeriniň plyonka normalyna garanyňda iň ýokary egiliş burçunyň 25° - 29° bolandygy bellenildi (1-nji surat, A we E), bu bolsa RC A keskin kontrastly-LH116-da αβ-1-iň 2° - 8° egilmegi bilen emele geldi (1-nji surat, B we F). Ikinji we üçünji geterodimerler degişlilikde 12° - 22° we 5° - 10° egilýär. RC-niň sterik päsgelçilikleri sebäpli, αβ-1-iň egilişi αβ-nyň ikinji jübütini öz içine almaýar (1F suratdaky 16-njy αβ-a gabat gelýär), şeýlelik bilen LH1 halkasynda aýdyň boşluk emele gelýär (1-nji surat, A we E). Iki αβ geterodimeriniň ýoklugy, dört BChl we iki karotinoidiň ýitmegi bilen birlikde, karotinoidleriň hiç biri burulýan αβ-1 kiçi birligine baglanmaýar, netijede 13 Vegetarian we 28 BChl karotinoidini öz içine alýan LH114-W halkasy emele gelýär. αβ1-den 7-ä çenli sebitlerdäki iki kompleksiň ýerli çözgüt bahalandyrmalary LH1 halkasynyň galan bölegindäkiden pes, bu bolsa RC QB ýerine golaý LH1 kiçi birliginiň içki plastikligini görkezip biler (4-nji surat).
RC-LH114-W (A we B) we RC-LH116 (C we D) suratlary 1-nji suratdaky (B we D) şol bir ýokarky görnüş/ýan görnüş (A we B) (A we C) we boşluk ýüzünden görkezilýär. Reňkli düwmeler sag tarapda görkezilýär.
Stehiometrik gatnaşygy 1:14 bolan ýeke-täk häsiýetli esasy kompleks Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeridir (13). Şeýle-de bolsa, W we PufX belogynyň hiç hili aýdyň gomologiýasy ýok we olar degişli LH1 gurluşlaryna düýpli täsir edýär. PufX, RC-H kiçi birliginiň (13) sitoplazmatik tarapy bilen Rps. palustris LH116αβ-16-a laýyk gelýän ýagdaýda özara täsirleşýän N-terminal sitoplazmatik domeni bolan ýeke-täk TMH-dir. PufX, RC-LH1 bilen sitohrom bcl toplumynyň arasynda hinon/hinolon alyş-çalşygy üçin kanal döredýär we ähli Rba. sphaeroides esasy kompleksinde bar (13). Monomer-monomer serhedi Rba-da bolsa-da. RC-LH1-PufX dimer sfaeroidesleri RC-LH114-W-da W belogynyň baglanyşyk ýerinde ýerleşýär we PufX we belog-W tarapyndan döredilen boşluk deň derejede ýerleşýär (S7A surat). RC-LH114-W-daky boşluk, şeýle hem W belogy ýa-da PufX bilen baglanyşykly bolmadyk peptidler tarapyndan emele gelýän Pseudomonas rosea LH1-iň gipotetiki hinon kanaly (8) bilen deňleşdirilen (S7B surat). Mundan başga-da, Blc-daky hinon kanaly. Bir γ kiçi birligini (7) aýyrmak arkaly emele gelen zumrut ýaşyl LH1 meňzeş ýagdaýda ýerleşýär (S7C surat). Dürli beloklar arkaly amala aşyrylsa-da, bu hinon/hinolol kanallarynyň RC-LH1 toplumynda umumy ýagdaýda peýda bolmagy, W belogynyň döreden boşlugynyň hinon kanaly hökmünde hereket edip biljekdigini görkezýän konwergent ewolýusiýanyň mysaly bolup görünýär.
LH114-W halkasyndaky boşluk, beloklardaky ýaly belok gözenegi arkaly iki domeni birleşdirmegiň ýerine, RC-LH114-W toplumynyň içki giňişligi bilen esasy membrananyň arasynda üznüksiz membran sebitiniň emele gelmegine mümkinçilik berýär (1G surat). RC-LH116 toplumy ýapyk Tch. Iňňe ýaly komplekse meňzeýär (22) (1H surat). Hinonuň membrana arkaly diffuziýasy dar belok kanaly arkaly diffuziýadan has çalt bolany üçin, açyk LH114-W halkasy ýapyk LH116 halkasyna garanyňda RC-niň has çalt öwrülmegine mümkinçilik berip biler we hinonuň RC-e diffuziýasy has çäklendirilip bilner. W belogynyň RC arkaly hinonlaryň öwrülmegine täsir edýändigini ýa-da etmeýändigini barlamak üçin, biz ubikinon 2-niň (UQ2) belli bir konsentrasiýasynda (gysga izopren guýrugy bolan tebigy UQ10-yň analogy) sitohrom oksidlenme synagyny geçirdik (2E surat). Şelatlanan hinonuň bolmagy görünýän Mihaelis yzygiderliliginiň takyk kesgitlenmegine päsgel berse-de (RC-LH114-W we RC-LH116 degişlilikde 0,2±0,1μM we 0,5±0,2μM üçin amatly), RC-LH114-W-nyň iň ýokary tizligi (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116-dan (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) 28±5% uly.
Ilki başda protein-W-niň esasy kompleksiň takmynan 10% -inde bardygyny çakladyk (16); bu ýerde pes ýagtylykly, orta ýagtylykly we ýokary ýagtylykly ösüş öýjükleriniň doldurylyş derejesi degişlilikde 15±0.6%, 11±1% we 0.9±0.5% (2F surat). Mass spektrometriýasynyň mukdary deňeşdirmesi gistidin teginiň goşulmagynyň ýabany görnüşli ştammlara garanyňda protein-W-niň deňeşdirme mukdaryny azaltmandygyny görkezdi (P = 0.59), şonuň üçin bu derejeler üýtgedilen protein-W-niň artefakty däl (S10 surat). Şeýle-de bolsa, RC-LH1 kompleksinde protein-W-niň bu pes doldurylyş derejesi käbir RC-leriň çaltlaşdyrylan tizlikde öwrülmegine mümkinçilik berip biler, şeýlelik bilen RC-LH116 kompleksinde hinon/hinolon çalşygynyň haýallaşmagyny azaldýar. Ýokary ýagtylyk doldurylyş derejesiniň soňky transkriptomika maglumatlary bilen gabat gelmeýändigini gördük, bu bolsa pufW geniniň ekspresiýasynyň güýçli ýagtylyk astynda artýandygyny görkezýär (S11 surat) (23). pufW transkripsiýasy bilen protein-W-niň RC-LH1 kompleksine goşulmagynyň arasyndaky tapawut çylşyrymlydyr we proteiniň çylşyrymly düzgünleşdirilişini görkezip biler.
RC-LH114-W-da 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilholin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) we 29 β-DDM molekulasy bölünip alyndy we onda modelleşdirildi: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG we 12 βDDM. RC-LH116 (5-nji surat, A we B). Bu iki gurluşda CDL kompleksiň sitoplazmatik tarapynda diýen ýaly ýerleşýär, POPC, POPG we β-DDM bolsa esasan lüminal tarapda ýerleşýär. RC-LH114-W toplumynyň αβ-1-den αβ-6-a çenli sebitinde iki lipid we ýuwujy serişde molekulasy bölünip alyndy (5A surat), bäşisi bolsa RC-LH116-nyň deň sebitinde bölünip alyndy (5B surat). Kompleksiň beýleki tarapynda, esasan hem CDL-de, RC bilen αβ-7-den αβ-13-e çenli toplanan has köp lipidler tapyldy (5-nji surat, A we B). Gurluş taýdan çözülen beýleki lipidler we ýuwujy serişdeler LH1 halkasynyň daşynda ýerleşýär we gowy çözülen asil zynjyrlary LH1 kiçi birlikleriniň arasynda uzalýar, olar RC-LH114-W-da β-DDM hökmünde kesgitlenýär we β-DDM we POPC-LH116-nyň RC A garyndysynda β-DDM hökmünde kesgitlenýär. Biziň gurluşymyzdaky helatlaşdyryjy lipidleriň we ýuwujy serişdeleriň meňzeş ýerleşişleri olaryň fiziologik taýdan möhüm baglanyşyk ýerleridigini görkezýär (S12A surat). Tch-däki deň molekulalaryň ýerleşişleri hem gowy konsistensiýa eýedir. Gentle we Trv. 970 RC-LH1s ştammy (S12 surat, B-den E-ä çenli) (9, 12) we lipid baş toparynyň wodorod baglanyşyk galyndylary yzygiderlik deňleşdirmesinde gowy saklanyş görkezdi (S13 surat), bu bolsa RC-e baglanýan CDL-iň saklanýandygyny görkezýär (24), bu ýerler RC-LH1 toplumynda saklanyp bilner.
(A we B) RC-LH114-W (A) we RC-LH116 (B) peptidleri multfilmler bilen, pigmentler bolsa 1-nji suratdaky reňk shemasy ulanylyp, taýajyklar bilen görkezilýär. Lipidler gyzyl reňkde, ýuwujy serişdeler bolsa çal reňkde görkezilýär. RC QA we QB ýerlerine baglanyşykly UQ sary reňkde, izolýasiýa edilen UQ bolsa gök reňkde. (C we D) (A) we (B) bilen birmeňzeş görnüşler, lipidler aýrylan. (E-den G-e çenli) RC-LH116-dan Q1(E), Q2(F) we Q3(G)-niň ulaldylan görnüşi, biri-birine täsir edýän gapdal zynjyrlar bilen. Wodorod baglanyşyklary gara punktir çyzyklar hökmünde görkezilýär.
RC-LH116-da, zarýad bölmek prosesinde elektron geçişine gatnaşýan RC QA we QB UQ-nyň ikisi hem öz baglanyş ýerlerinde parçalanýar. Şeýle-de bolsa, RC-LH114-W-da QB hinon çözülmedi we aşakda jikme-jik ara alnyp maslahatlaşylar. QA we QB hinonlaryndan başga-da, RC-LH114-W gurluşynda iki sany helatlanan UQ molekulasy (RC we LH1 halkalarynyň arasynda ýerleşýär) olaryň gowy çözülen baş toparlaryna (degişlilikde Q1 we Q2-de ýerleşýär) görä bölünýär. boşluk). 5C surat). Q1-e iki izopren birligi berilýär we dykyzlyk kartasy Q2-niň doly 10 izopren guýrugyny çözýär. RC-LH116 gurluşynda üç sany helatlanan UQ10 molekulasy (Q1-den Q3-e, 5D surat) çözüldi we ähli molekulalar guýrugyň dowamynda aýdyň dykyzlyga eýedir (5-nji surat, D-den G-e çenli). Iki gurluşda Q1 we Q2-niň hinon baş toparlarynyň ýerleşýän ýerleri ajaýyp yzygiderlilige eýedir (S12F surat) we olar diňe RC bilen özara täsirleşýär. Q1 RC-LH114-W-niň W aralygynyň girişinde ýerleşýär (1G we 5 suratlar, C, D we E), Q2 bolsa QB baglanyş ýeriniň golaýynda ýerleşýär (5 surat, C, D) we F). Saklanan L-Trp143 we L-Trp269 galyndylary Q1 we Q2-e örän ýakyn we mümkin bolan π-üýşme özara täsirlerini üpjün edýär (5 surat, E we F suratlar, şeýle hem S12 suratlar). Q1-iň distal kislorodyndan 3.0 Å alan L-Gln88 güýçli wodorod baglanyşygyny üpjün edýär (5E suratlar); bu galyndy iň uzak gatnaşykdan başga ähli RC-lerde saklanýar (S13 suratlar). L-Ser91 beýleki RC-leriň köpüsinde Thr-iň ýerine konserwatiw ýagdaýda çalşyrylýar (S13-nji surat), Q1-iň metil kislorodyndan 3,8 Angstromdyr we gowşak wodorod baglanyşyklaryny üpjün edip biler (5E-nji surat). Q3-iň belli bir özara täsiri ýok ýaly, ýöne RC-M kiçi birligi bilen LH1-α kiçi birliginiň 5-den 6-a çenli arasyndaky gidrofob sebitde ýerleşýär (5-nji surat, D we G). Q1, Q2 we Q3 ýa-da golaýdaky helatlanan hinonlar hem Tch. Gentle, Trv. Strain 970 we Blc-de çözüldi. Iris gurluşy (9, 10, 12) RC-LH1 toplumyndaky goragly kömekçi hinon baglanyşyk ýerine görkezýär (S12G-nji surat). RC-LH116-daky bäş sany parçalanan UQ, ýokary öndürijilikli suwuklyk hromatografiýasy (HPLC) arkaly kesgitlenen her bir kompleksiň 5.8±0.7 bilen gowy gabat gelýär, RC-LH114-W-daky üç sany parçalanan UQ bolsa 6.2±0.3 ölçeg bahasyndan pes (S14 surat) gurluşda çözülmedik UQ molekulalarynyň bardygyny görkezýär.
Psewdo-simmetriki L we M polipeptidleriniň her biri bäş TMH saklaýar we bir BChl dimerini, iki BChl monomerini, iki bakteriofag (BPh) monomerini we bir gem däl demiri we bir ýa-da iki UQ10 molekulasyny birleşdirýän geterodimer emele getirýär. Terminal keton toparynda wodorod baglanyşyklarynyň bolmagy we onuň Rps-de belli toplanmagy arkaly karotinoidler cis-3,4-dehidroorhodopin diýlip atlandyrylýan M-kiçi birligine goşulýar. Görnüşler (25). RC-H-niň daşky membrana domeni membrana ýeke TMH arkaly berkidilýär. Umumy RC gurluşy baglanyşykly görnüşleriň (meselem, Rba) üç kiçi birligi RC-ne meňzeýär. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl we BPh makrosiklleri, karotinoid esasy we gem däl demir, şeýle hem QA ýerinde UQ10 baş topary we RC-LH116-da QB hinon (S15-nji surat) bu gurluşlaryň çözgüt aralygynda gabat gelýär.
Dürli QB meýdançasynyň doldurylma derejesi bolan iki RC gurluşynyň elýeterliligi, QB hinon baglanyşygy bilen baglanyşykly yzygiderli konformasiýa üýtgeşmelerini barlamak üçin täze mümkinçilik döredýär. RC-LH116 toplumynda QB hinon doly baglanyşykly "ýakyn" ýagdaýda ýerleşýär (26), ýöne RC-LH114-W-nyň bölünişinde QB hinon ýok. RC-LH114-W-da QB hinon ýok, bu geň galdyryjy, sebäbi toplum işjeň, gurluş taýdan çözülen QB hinonly RC-LH116 toplumyna garanyňda has köp. Iki LH1 halkasy alty töweregi hinony helatlasa-da, bäşi ýapyk RC-LH116 halkasynda gurluş taýdan çözülýär, açyk RC-LH114-W halkasynda bolsa diňe üçüsi gurluş taýdan çäkli. Bu gurluş bozulmasynyň artmagy RC-LH114-W QB ýerleriniň çalt çalşylmagyny, kompleksde hinon kinetikasynyň çaltlaşmagyny we LH1 halkasyndan geçmegiň ähtimallygynyň artmagyny görkezip biler. Biz RC-LH114-W-nyň RC QB ýerinde UQ-nyň ýoklugynyň has çylşyrymly we has işjeň kompleksiň netijesi bolup biljekdigini we RC-LH114-W-nyň QB ýeriniň UQ dolanyşygynda derrew doňandygyny çaklaýarys. Aýratyn tapgyr (QB ýerine giriş ýapyldy) bu işjeňligiň konformasiýasyny görkezýär.
QB bolmasa, L-Phe217-niň UQ10 baglanyşygy bilen gabat gelmeýän ýagdaýa öwrülmegi, sebäbi ol guýrugyň birinji izopren birligi bilen giňişlik çaknyşmagyna sebäp bolar (6A surat). Mundan başga-da, esasy konformasiýa üýtgeşmeleri, esasanam L-Phe217-niň QB baglanyş jübüsine süýşürilen spiral de (TMH D we E arasyndaky halkadaky gysga spiral) we L-Tyr223-iň aýlanmagy (6A surat) M-Asp45 çarçuwasy bilen wodorod baglanyşygyny bozmak we QB baglanyş ýeriniň girişini ýapmak üçin (6B surat). Spiral öz binýadynda aýlanýar, L-Ser209-yň Cα 0.33Å süýşýär, L-Val221Cα bolsa 3.52Å süýşýär. TMH D we E-de synlanyp bilinýän üýtgeşmeler ýok, olar iki gurluşda hem üst-üste bolýar (6A surat). Bilşimiz ýaly, bu tebigy RC-de QB ýerini ýapýan ilkinji gurluşdyr. Doly (QB bilen baglanyşykly) gurluş bilen deňeşdirme, hinon reduksasiýa edilmezden öň, onuň hinona girmegi üçin konformasiýa üýtgeşmesiniň zerurdygyny görkezýär. L-Phe217 hinon baş topary bilen π-üýşme özara täsirini emele getirmek üçin aýlanýar we spiral daşary süýşýär, bu bolsa L-Gly222-niň skeletine we L-Tyr223-iň gapdal zynjyryna durnukly wodorod baglanyşyk gurluşy bolan wodorod baglanyşyk ulgamyny döretmäge mümkinçilik berýär (6-njy surat, A we C).
(A) Gologrammanyň (L zynjyry, mämişi/M zynjyry, gyzyl reňk) we apo (çal reňk) gurluşlarynyň üst-üst bolýan karikaturasy, onda esasy galyndylaryň çybyk şekilli görnüşi görkezilýär. UQ10 sary çyzyk bilen görkezilýär. Nokatly çyzyk tutuş gurluşda emele gelen wodorod baglanyşyklaryny görkezýär. (B we C) Apolipoproteiniň we tutuş halka gurluşynyň ýüz keşbi, degişlilikde gök reňkde L-Phe217 we gyzyl reňkde L-Tyr223-iň gapdal zynjyr kislorodyny görkezýär. L kiçi birligi mämişi reňkde; M we H kiçi birlikleri reňklenmedik. (D we E) Apolipoprotein (D) we tutuş (E) RC QB ýerleri [degişlilikde (A) bilen reňkleň] we Thermophilus thermophilus PSII (ýaşyl, plastik hinon bilen gök; PDB ID: 3WU2) Deňleşdiriň (58).
Garaşylmadyk ýagdaýda, LH1-siz QB ýetmezçilikli RC-leriň birnäçe gurluşy elýeterli bolsa-da, bu gözlegde syn edilen konformasiýa üýtgeşmeleri öň habar berilmedi. Bularyň arasynda Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) we Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29)-dan QB-niň azalma gurluşy bar, bularyň hemmesi umumy QB gurluşy bilen diýen ýaly birmeňzeşdir. 3PRC-ni ýakyndan barlamak LDAO (Lauril Dimetil Amine Oxide) ýuwujy serişde molekulalarynyň QB pozisiýasynyň girişinde baglanýandygyny, bu bolsa ýapyk konformasiýa öwrülmeginiň öňüni alyp biljekdigini görkezdi. LDAO 1EYS ýa-da 1OGV-de şol bir ýerde parçalanmasa-da, bu RC-ler şol bir ýuwujy serişde ulanylyp taýýarlanylýar we şonuň üçin şol bir täsiri döredip biler. Rba-nyň kristal gurluşy. Sitohrom c2 (PDB ID: 1L9B) bilen bilelikde kristallaşan Sphaeroides RC-niň hem ýapyk QB ýeri bar ýaly. Şeýle-de bolsa, bu ýagdaýda RC-M polipeptidiniň N-terminal sebiti (Q spiralyndaky Tyr galyndysynyň H baglanyşygy arkaly QB baglanyş ýeri bilen özara täsirleşýär) tebigy däl konformasiýany kabul edýär we QB konformasiýa üýtgemesi has giňişleýin öwrenilmeýär (30). Ynamlandyryjy zat, RC-LH114-W gurluşynda M polipeptidiniň şeýle deformasiýasyny görmändigimizdir, bu bolsa RC-LH116 RC-niň N-terminal sebiti bilen diýen ýaly birmeňzeşdir. Şeýle hem, ýuwujy serişdä esaslanýan LH1 antennasynyň ýok edilmeginden soň, PDB-däki apolipoprotein RC-leriň çözülendigini, bu bolsa RC bilen töweregindäki LH1 halkasynyň içki ýüzüniň arasyndaky boşlukdaky içki hinon howuzlaryny we lipidleri ýok edendigini bellemek gerek (31, 32). RC, az durnukly we taýýarlamak prosesinde köplenç ýitirilýän parçalanýan QB hinonyndan başga ähli kofaktorlary saklaýandygy üçin işjeň bolmagynda galýar (33). Mundan başga-da, RC-den LH1 we tebigy siklik lipidleriň aýrylmagynyň zarýad bilen bölünen P+QB-ýagdaýynyň ömrüniň gysgalmagy ýaly funksiýalara täsir edip biljekdigi mälim (31, 34, 35). Şonuň üçin, RC-niň töweregindäki ýerli LH1 halkasynyň bolmagynyň "ýapyk" QB ýerini saklap galyp, şonuň bilen QB-niň golaýyndaky ýerli gurşawy saklap biljekdigini çaklaýarys.
Apolipoprotein (QB hinonsyz) we tutuş gurluş QB ýeriniň dolanyşygynyň diňe iki sany suratyny görkezýär, birnäçe wakalaryň däl-de, gidrokinon tarapyndan gaýtadan baglanmagyň öňüni almak üçin baglanyşygyň berkidilip bilinjekdigine şaýatlyk edýän alamatlar bar. Substratyň tormozlanmagynyň öňüni almak üçin hynololonyň we hinonun apolipoproteiniň QB ýeriniň golaýyndaky özara täsiri tapawutly bolup biler, bu bolsa onuň RC tarapyndan ret edilmegine getirýär. Konformasiýa üýtgeşmeleriniň hinonlaryň baglanyşynda we reduksiýasynda rol oýnaýandygy köpden bäri teklip edilýär. Doňan RC-leriň garaňky adaptasiýadan soň hinonlary reduksiýa etmek ukyby bozulýar (36); Rentgen kristallografiýasy bu zyýanyň QB hinonlarynyň işjeň proksimal pozisiýadan takmynan 4,5 Å uzaklykda "distal" konformasiýada saklanmagy bilen baglanyşyklydygyny görkezýär (26), 37). Biz bu distal baglanyşygyň konformasiýasynyň apolipoprotein bilen doly halka gurluşynyň arasyndaky aralyk ýagdaýyň suratydygyny çaklaýarys, bu bolsa hinon bilen başlangyç özara täsirden we QB ýeriniň açylyşyndan soň bolýar.
Käbir fototrofik bakteriýalaryň we sianobakteriýalaryň, suw otlarynyň we ösümlikleriň PSII toplumynda tapylan II görnüşli RC gurluş we funksional goraglylyk häsiýetine eýedir (38). 6-njy suratda (D we E) görkezilen gurluş deňleşdirmesi PSII RC-leri bilen bakteriýa RC toplumynyň QB ýeriniň arasyndaky meňzeşligi nygtaýar. Bu deňeşdirme uzak wagtlap hinon baglanyşygynyň we gaýtarylmagynyň ýakyn baglanyşykly ulgamlaryny öwrenmek üçin nusga bolup geldi. Öňki neşirlerde konformasiýa üýtgeşmeleriniň hinonlaryň PSII gaýtarylmagy bilen birlikde bolýandygy aýdylýar (39, 40). Şonuň üçin, RC-niň ewolýusiýa taýdan saklanmagyny göz öňünde tutup, öň syn edilmedik bu baglanyşyk mehanizmi kislorodly fototrofik ösümliklerde PSII RC-niň QB ýerine hem degişli bolup biler.
Rps ΔpufW (belliksiz pufW ýok edilmegi) we PufW-His (tebigy pufW lokusyndan ekspresirlenen C-terminal 10x His-bellikli belok-W) ştammlary. palustris CGA009 öňki işimizde (16) beýan edildi. Bu ştammlar we izogen ýabany görnüşli ene-ata PYE (her 5 g litr -1) (LB-de -80 °C-da saklanýar, 50% (w/v) gliserol) belok, aşhana ekstrakty we suksinat) agar [1.5% (w/v)] saklaýar) plastinkasynda az sanly öýjükleri çyzmak arkaly doňduryjydan alyndy. Plitalar ota temperaturasynda garaňky ýerde anaerob şertlerde gije inkubasiýa edildi we soňra OSRAM 116-W galogen lampalary (RS Components, Beýik Britaniýa) tarapyndan üpjün edilen ak yşyk (~50 μmolm-2 s-1) bilen 3-5 günläp, ýekeje koloniýa peýda bolýança ýagtylandyryldy. 0,1% (w/v) kasaminokislotalar (mundan beýläk M22 diýlip atlandyrylýar) bilen goşmaça 10 ml M22+ ortamyny (41) sanjym etmek üçin ýekeje koloniýa ulanyldy. Kultura pes kislorod şertlerinde garaňkyda 34°C-de 48 sagatlap 180 aýlaw/minutda çaýkamak bilen ösdürildi, soňra 70 ml medeniýet şol bir şertlerde 24 sagatlap sanjym edildi. 30 ml umumy burçly açyk aýna çüýşede 30 ml M22 ortamyny sanjym etmek üçin 1 ml göwrümli ýarym aerob medeniýet ulanylýar we steril magnit güýji bilen garyşdyryjy taýak bilen 48 sagatlap garyşdyrylyp (~50μmolm-2 s-1) şöhlelendirilýär. Soňra 30 ml medeniýet şol bir şertlerde takmynan 1 litr medeniýet sanjym edildi, soňra ol 72 sagatlap ~200 μmolm-2 s-1-de ýagtylandyrylan takmynan 9 litr medeniýet sanjym etmek üçin ulanyldy. Öýjükler 7132 RCF-de 30 minutlap santrifuga arkaly ýygnaldy, ~10 ml 20 mM tris-HCl-de (pH 8.0) gaýtadan eridildi we gerek bolýança -20°C-de saklandy.
Ereden soň, gaýtadan suspenziýa edilen öýjüklere dezoksiribonukleaza I (Merck, Beýik Britaniýa), lizozim (Merck, Beýik Britaniýa) we iki sany Roche holoenzim proteaza ingibitor tabletkasyny (Merck, Beýik Britaniýa) goşuň. 20,000 psi fransuz basyş öýjüklerinde (Aminco, ABŞ) öýjükler 8-12 gezek bölündi. Bölünmedik öýjükleri we eremeýän galyndylary 18,500 RCF-de 4°C-de 15 minutlap santrifugalamak arkaly aýyrandan soň, membrana pigmentli lizatdan 43,000°C-de 2 sagatlap 113,000 RCF-de santrifugalamak arkaly çökdürildi. Ereýän fraksiýany zyňyň we reňkli membranany 100-200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde gaýtadan suspenziýa ediň we görünýän agregatlar galmaýança gomogenleşdiriň. Asma membrana 2% (w/v) β-DDM saklaýan 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ABŞ) içinde 4°C-da ýumşak garyşdyryp, garaňky ýerde 1 sagatlap inkubasiýa edildi. Soňra galan eremeýän maddalary aýyrmak üçin 150,000 RCF-i 4°C-da 1 sagatlap eredip, 70°C-da sentrifuga edildi.
ΔpufW ştammyndan ereýän membrana üç sütun göwrümi (CV) baglanyşyk buferi [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM saklaýan] bolan 50 ml DEAE Sefaroza ion alyş-çalyş sütunyna ulanyldy. Sütüni iki CV baglanyşyk buferi bilen ýuwuň, soňra sütün 50 mM NaCl saklaýan iki baglanyşyk buferi bilen ýuwuň. RC-LH116 toplumy 1.75 CV-de 150-den 300 mM NaCl-e çenli çyzykly gradient bilen (baglanyşyk buferinde) elýut edildi, galan baglanyşyk toplumy bolsa 0.5 CV-de 300 mM NaCl saklaýan baglanyşyk buferi bilen elýut edildi. 250 we 1000 nm aralygyndaky siňdiriş spektrini ýygnaň, siňdiriş gatnaşygy (A880/A280) 1-den ýokary bolan bölegi 880-den 280 nm-e çenli aralykda saklaň, ony baglaýjy buferde iki gezek suwuklandyryň we DEAE sütüninde arassalaýyşda şol bir prosedurany ýene-de ulanyň. A880/A280 gatnaşyklary 1,7-den ýokary we A880/A805 gatnaşyklary 3,0-dan ýokary bolan bölekler bilen suwuklandyryň, ion çalşygynyň üçünji tapgyryny ýerine ýetiriň we A880/A280 gatnaşyklary 2,2-den ýokary we A880/A805 gatnaşyklary 5,0-den ýokary bolan bölekler bilen saklaň. Bölekleýin arassalanan kompleks Amicon 100,000 molekulýar agramly kesiş (MWCO) merkezden gaçyryş süzgüçinde (Merck, Beýik Britaniýa) ~2 ml çenli konsentrirlenen we 200 mM NaCl buferini öz içine alýan Superdex 200 16/600 ölçegli çykaryş sütünine (GE Healthcare, ABŞ) ýüklenilen we soňra şol bir buferde 1,5 CV-de elusiýa edilen. Ölçegli çykaryş fraksiýasynyň siňdiriş spektrlerini ýygnaň we siňdiriş spektrlerini 2,4-den ýokary A880/A280 we 5,8-den 100 A880-e çenli A880 gatnaşyklary bilen konsentrleşdiriň we derrew krio-TEM toruny taýýarlamak ýa-da saklamak üçin ulanyň. Zerur bolýança -80°C-de saklaň.
PufW-His ştammyndan alnan ereýän membrana IMAC buferinde (GE Saglyk gullugy) 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose sütünine (200 mM NaCl we 0.03% (w/w) saklaýan 20 mM tris-HCl (pH 8.0)) ulanyldy. v) β-DDM]. Sütün bäş CV IMAC buferi bilen, soňra bolsa 10 mM gistidin saklaýan bäş CV IMAC buferi bilen ýuwuldy. Esasy kompleks sütünden 100 mM gistidin saklaýan bäş IMAC buferi bilen elusiýa edildi. RC-LH114-W kompleksini saklaýan fraksiýa Amicon 100,000 MWCO süzgüji (Merck, Beýik Britaniýa) bilen enjamlaşdyrylan garyşdyrylan bakda ~10 ml çenli konsentrlenýär, baglaýjy bufer bilen 20 gezek suwuklandyrylýar we soňra 25 ml goşulýar. DEAE Sepharose sütüninde bufere baglanan dört CV öňünden ulanylýar. Sütüni dört sany CV baglaýjy bufer bilen ýuwuň, soňra kompleksi sekiz CV-de 0-dan 100 mM NaCl-a çenli çyzykly gradientde (baglaýjy buferde) we galan dört CV-de 100 mM baglaýjy buferi saklaýan elute ediň. Natriý hloridinde elute edilen galan kompleksler 2,4-den ýokary A880/A280 gatnaşygy we 4,6-dan ýokary A880/A805 gatnaşygy bilen birleşdirilende Amicon 100,000 MWCO merkezden gaçyryjy süzgüçde ~2 ml-e çenli konsentrirlenen we öňünden 1,5 CV IMAC bilen doldurylan. Bufer Superdex 200 16/600 ölçegli çykaryjy sütün bilen deňleşdirilen we soňra şol bir buferde 1,5 CV-de elute edilen. Ölçeg-çykaryş fraksiýalarynyň siňdiriş spektrlerini ýygnaň we siňdiriş spektrlerini 2.1-den ýokary A880/A280 gatnaşyklary we 4.6-dan 100 A880-e çenli A880/A805 gatnaşyklary bilen jemleň, olar derrew doňdurylan TEM toruny taýýarlamak üçin ulanylýar ýa-da zerurlyk bolýança -80°C-de saklanýar.
Pes temperaturaly TEM torlaryny taýýarlamak üçin Leica EM GP çümdüriji doňduryjy ulanyldy. Kompleks IMAC buferinde A880 of 50-e çenli suwlandyryldy we soňra 5μl täze ýagtylyk bilen çykarylan QUANTIFOIL 1.2/1.3 uglerod bilen örtülen mis toruna (Agar Scientific, Beýik Britaniýa) ýüklendi. Tory 20°C we 60% otnositel çyglylykda 30 sekuntlap ​​inkubasiýa ediň, soňra 3 sekuntlap ​​guradyň we soňra -176°C-da suwuk etanda öçüriň.
RC-LH114-W toplumynyň maglumatlary 300 kV tizlenýän naprýaženiýede işleýän, nominal ulaltma 130,000× we energiýasy 20 eV bolan Titan Krios mikroskopy bilen eBIC-de (Elektron Biogörüntüleme Merkezi) (Britaniýa Almaz Yşyk Çeşmesi) ýazylyp alyndy. Maglumatlary ýygnamak üçin sanamak režiminde suratlary ýazmak üçin K2 pik detektory bolan Gatan 968 GIF Quantum ulanyldy. Kalibrlenen piksel ölçegi 1.048Å, doza tizligi bolsa 3.83 e-Å-2s-1. Film 11 sekuntda ýygnaldy we ony 40 bölege böldi. Mikroskopy gaýtadan fokuslamak üçin uglerod bilen örtülen meýdany ulanyň, soňra her deşikden üç film ýygnaň. Jemi 3130 film ýygnaldy, defokus gymmatlyklary -1 bilen -3μm aralygynda.
RC-LH116 toplumy üçin maglumatlar Asterbury Biostruktur Laboratoriýasynda (Lids uniwersiteti, Beýik Britaniýa) şol bir mikroskop arkaly ýygnaldy. Maglumatlar 130 k ulaltma bilen sanamak režiminde ýygnaldy we piksel ölçegi 4.6 e-Å-2s-1 dozasy bilen 1.065 Å-e çenli kalibrlendi. Film 12 sekuntda ýazylyp alyndy we 48 bölege bölündi. Jemi 3359 film ýygnaldy, defokus gymmatlyklary -1 bilen -3μm aralygynda boldy.
Ähli maglumatlary işläp taýýarlamak Relion 3.0 turbageçirijisinde (42) amala aşyrylýar. Şöhle hereketini doza agramy arkaly düzetmek üçin Motioncorr 2 (43) ulanyň, soňra CTF (kontrast geçirmek funksiýasy) parametrini kesgitlemek üçin CTFFIND 4.1 (44) ulanyň. Bu başlangyç işläp taýýarlamak tapgyrlaryndan soňky tipiki fotomikrograflar 2-nji suratda görkezilen. S16. Awtomatiki saýlama şablony 250 pikselli kadrda we salgylanmasyz iki ölçegli (2D) klassifikasiýada 1000 bölejigiň takmynan 250 pikselini el bilen saýlamak arkaly döredilýär, şeýlelik bilen nusga hapalanmasyna laýyk gelýän ýa-da tapawutlandyryp boljak häsiýetleri bolmadyk klassifikasiýalar ret edilýär. Soňra ähli mikrofotografiýalarda awtomatiki saýlama geçirildi we RC-LH114-W 849,359 bölejigiň, RC-LH116 toplumy bolsa 476,547 bölejigiň boldy. Saýlanan ähli bölejikler iki tapgyrda salgylanmasyz 2D klassifikasiýasyndan geçdiler we her gezek geçirilenden soň, uglerod meýdanyna gabat gelýän bölejikler, nusga hapalanmagy, aýdyň alamatlaryň ýokdugy ýa-da güýçli üst-üste düşýän bölejikler ret edilýär, netijede degişlilikde 772,033 (90.9%) we 359,678 (75.5%) RC-LH114-W we RC-LH116 3D klassifikasiýalary üçin bölejikler ulanylýar. Ilkinji 3D salgylanma modeli stohastik gradient düşüş usuly arkaly döredildi. Ilkinji modeli salgylanma hökmünde ulanyp, saýlanan bölejikler 3D-de dört kategoriýa bölünýär. Bu kategoriýadaky modeli salgylanma hökmünde ulanyp, iň uly kategoriýadaky bölejiklerde 3D arassalamak işlerini ýerine ýetiriň, soňra ergin meýdanyny örtmek üçin başlangyç 15Å pes geçirijilikli süzgüji ulanyň, ýumşak gyralaryň 6 pikselini goşuň we ýokarky detektoryň Gatan K2 depesi Modulýasiýa geçiş funksiýasyny düzetmek üçin pikselleri gaýtadan işleň. RC-LH114-W maglumatlar toplumy üçin bu başlangyç model maskanyň gyralaryndaky güýçli dykyzlygy aýyrmak arkaly üýtgedildi (UCSF Chimera-daky esasy kompleks dykyzlygyndan aýryldy). Netijede dörän modeller (RC-LH114-W we RC-LH116 çözgütleri degişlilikde 3.91 we 4.16 Å) 3D klassifikasiýasynyň ikinji tapgyry üçin salgylanma hökmünde ulanylýar. Ulanylan bölejikler başlangyç 3D klassyna toparlanýar we goňşuçylyk bilen güýçli korrelasiýany öz içine almaýar. Üst-üste düşýär ýa-da aýdyň gurluş aýratynlyklarynyň ýoklugy. 3D klassifikasiýasynyň ikinji tapgyryndan soň, iň ýokary çözgütli kategoriýa saýlanyldy [RC-LH114-W üçin bir kategoriýa 377,703 bölejik (44.5%), RC-LH116 üçin jemi 260,752 bölejik (54.7%) bolan iki kategoriýa bar, olar diňe kiçi tapawut bilen başlangyç aýlanmadan soň deňleşdirilende birmeňzeş bolýarlar]. Saýlanan bölejikler 400 piksellik gutuda gaýtadan ekstraksiýa edilýär we 3D arassalamak arkaly arassalanýar. Eriji maska ​​başlangyç 15Å pes geçirijilikli süzgüç, 3 pikselli karta giňeltmesi we 3 pikselli ýumşak maska ​​arkaly döredilýär. Her bölejik üçin CTF arassalamak, her bölejik üçin hereket düzedişi we her bölejik üçin CTF arassalamak, 3D arassalamak, eriji maskalamak we gaýtadan işlemek her ädimden soň netijede teksturany has-da arassalamak üçin ýerine ýetirilýär. FSC (Furýe gabygynyň korrelasiýa koeffisiýenti) kesiş bahasy 0,143 ulanylyp, RC-LH114-W we RC-LH116-nyň soňky modelleriniň çözgütleri degişlilikde 2,65 we 2,80Å-dir. Soňky modeliň FSC egrisi 2-nji suratda görkezilen. S17.
Ähli belok yzygiderlikleri UniProtKB-den göçürip alyndy: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M we RC-H belok yzygiderliklerini we Rba-nyň kristal gurluşyny öz içine alýan RC-niň gomologiýa modelini gurmak üçin SWISS-MODEL (45) ulanyldy. şablon hökmünde RC ulanyldy (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera-daky “karta laýyk gelmek” guralyny ulanyp, döredilen modeli karta (47) laýyklaşdyryň, belok gurluşyny gowulandyryň we kofaktor [4×BChlα (monomer kitaphanasynyň galyndysynyň ady = BCL), 2×BPhα (BPH), bir ýa-da iki görnüşli UQ10 (U10), bir gem däl demir (Fe) we bir 3,4-dihidroheksakarbonilholin (QAK)] goşuň. QAK monomer kitaphanasynda elýeterli däldigi sebäpli, ol PHENIX-däki eLBOW guraly arkaly parametrleşdirildi (49).
Soňra LH1 kiçi birligi guruldy. Ilki bilen, PHENIX-däki (49) awtomatiki gurluşyk guraly kartany we giriş hökmünde LH1-α we LH1-β belok yzygiderliklerini ulanyp, LH1 yzygiderliliginiň bir bölegini awtomatiki gurmak üçin ulanyldy. Iň doly LH1 kiçi birligini saýlaň, ony çykaryň we Coot-a ýükleň, ýiten yzygiderligi el bilen goşuň we iki BCl a (BCL) we spirilloksantin (CRT) goşmazdan öň tutuş gurluşy el bilen kämilleşdiriň [degişli Rps-e laýyklykda LH1 toplumynyň dykyzlygy we belli karotinoid mazmuny. Görnüşler (17)]. Doly LH1 kiçi birligini göçüriň we UCSF Chimera “Docking Map Tool”-y ulanyp, LH1 dykyzlygynyň goňşy model däl meýdanyna birikdiriň we soňra ony Coot-da kämilleşdiriň; ähli LH1 kiçi birlikleri modelleşdirilýänçä prosesi gaýtalaň. RC-LH114-W gurluşy üçin, Coot-daky paýlanmadyk dykyzlygy çykarmak arkaly, belok USCF Himera kartasyndaky galan belok däl komponentlerden bölünýär we Autobuild guraly başlangyç modeli döretmek üçin ulanylýar we galan kiçi birlikleri (belok-W) Modelleşdirme. PHENIX-de (49). Coot-da (48) dörän modele ýiten yzygiderlikleri goşuň we soňra tutuş kiçi birligi el bilen kämilleşdiriň. Galan paýlanmadyk dykyzlyk lipidleriň (CDL = CDL, POPC = 6PL we POPG = PGT-niň PDB monomer kitaphanasynyň ID-si), β-DDM ýuwujy serişdesiniň (LMT) we UQ10 molekulalarynyň (U10) utgaşmasyna laýyk gelýär. Model statistikasy we gabat gelmegiň wizual hili has-da gowulaşdyrylyp bilinmeýänçä, doly başlangyç modeli kämilleşdirmek üçin Coot-da PHENIX optimizasiýasyny (49) we el bilen optimizasiýany (48) ulanyň. Ahyrsoňy, ýerli kartany ýitileşdirmek üçin LocScale (50) ulanyň, soňra paýlanmadyk dykyzlygy modelirlemegiň we awtomatiki we el bilen optimizirlemegiň başga birnäçe sikllerini ýerine ýetiriň.
Degişli peptidler, kofaktorlar we degişli dykyzlyklarynda ýerleşýän beýleki lipidler we hinonlar 1-nji we 2-nji suratlarda görkezilen. S18-den S23-e çenli. Soňky modeliň statistik maglumatlary S1 tablisasynda görkezilen.
Başgaça görkezilmedik bolsa, UV/Vis/NIR siňdiriş spektrleri Cary60 spektrofotometrinde (Agilent, ABŞ) 250 nm-den 1000 nm-e çenli 1 nm aralyklarda we 0,1s integrasiýa wagtynda ýygnaldy.
Nusgany kwars küwetesinde 2 mm ýol bilen A880-e 1-den siňdiriň we 400 bilen 1000 nm aralygyndaky siňdiriş spektrini ýygnaň. Töwerekleýin dihroik spektrler Jasco 810 spektropolýarimetrinde (Jasco, Ýaponiýa) 400 nm bilen 950 nm aralygyndaky 1 nm aralyklarda 20 nm min-1 skanirleme tizliginde ýygnaldy.
Molar ýok edilme koeffisiýenti esasy kompleksi takmynan 50 A880-e çenli suwuklandyrmak arkaly kesgitlenýär. 10μl göwrümi 990μl baglanyşyk buferinde ýa-da metanolda suwuklandyryň we BChl dargamagyny azaltmak üçin derrew siňdiriş spektrini ýygnaň. Her bir metanol nusgasynyň BChl mukdary 54.8 mM-1 sm-1-iň 771 nm-däki ýok edilme koeffisiýenti bilen hasaplandy we ýok edilme koeffisiýenti kesgitlendi (51). Ölçenen BChl konsentrasiýasyny esasy kompleks konsentrasiýasyny kesgitlemek üçin 32-ä (RC-LH114-W) ýa-da 36-a (RC-LH116) bölüň, soňra ol buferde ýygnalan şol bir nusganyň siňdiriş spektrini kesgitlemek üçin ulanylýar. Öçme koeffisiýenti parallel. Her nusga üçin üç gezek gaýtalanýan ölçeg geçirildi we hasaplama üçin BChl Qy maksimumynyň ortaça siňdirişligi ulanyldy. RC-LH114-W-nyň 878 nm-de ölçenen sönme koeffisiýenti 3280±140 mM-1 sm-1, RC-LH116-nyň 880 nm-de ölçenen sönme koeffisiýenti bolsa 3800±30 mM-1 sm-1.
UQ10 (52)-däki usula görä san taýdan kesgitlenildi. Gysgaça aýdylanda, ters fazaly HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC ulgamy ulanylyp ýerine ýetirildi. 0,02% (w/v) demir hloridini öz içine alýan 50μl 50:50 metanol:hloroformda takmynan 0,02 nmol RC-LH116 ýa-da RC-LH114-W erediň we öňünden deňleşdirilen Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm inýeksiýa ediň. 40°C-da 1 ml-1 min-1-de HPLC ergininde (80:20 metanol:2-propanol) ×25 sm sütünçede erediň. 275 nm (UQ10), 450 nm (karotinoidler) we 780 nm (BChl)-de 1 sagatlap siňdirilişi gözegçilik etmek üçin HPLC ergininde izokratik elusiýany ýerine ýetiriň. 275 nm hromatogrammadaky 25,5 minutdaky iň ýokary çür integrasiýa edildi, onda başga anyklanyp bilinýän birleşmeler ýokdy. Integrasiýa edilen meýdan arassa standartlaryň 0-dan 5,8 nmol-a çenli inýeksiýasyndan hasaplanan kalibrleme egrisine salgylanyp, çykarylan UQ10-yň molar mukdaryny hasaplamak üçin ulanylýar (S14-nji surat). Her bir nusga üç gaýtalamada seljerildi we habar berlen ýalňyşlyk ortaça SD-e gabat gelýär.
Maksimum Qy siňdirilişi 0,1 bolan RC-LH1 toplumyny öz içine alýan ergin 30 μM azaldylan at ýüregi sitohromy c2 (Merck, Beýik Britaniýa) we 0-dan 50 μMUQ2 (Merck, Beýik Britaniýa) bilen taýýarlanyldy. Her UQ2 konsentrasiýasynda üç sany 1 ml nusga taýýarlanyldy we ölçemezden öň garaňkylyga doly uýgunlaşmak üçin garaňkyda 4°C-de gije inkubasiýa edildi. Eritme 300 nm alow/500 çyzykly tor, 1,24 mm giriş, 0,12 mm orta we 0,6 mm çykyş ýaryklary bilen enjamlaşdyrylan OLIS RSM1000 modul spektrofotometrine ýüklendi. Gözegçilik yşygyny aýyrmak üçin nusga fototrubkasynyň we salgylanma foto köpeldiji turbasynyň girişine 600 nm uzynlykdaky geçirijilik süzgüji goýuldy. Siňdiriliş 0,15 sekunt integrasiýa wagty bilen 550 nm-de gözegçilik edildi. Gyjyndyryjy şöhle 880 nm M880F2 LED-den (Ýagtylyk çykarýan diod) (Thorlabs Ltd., Beýik Britaniýa) DC2200 kontroller (Thorlabs Ltd., Beýik Britaniýa) arkaly 90% intensiwlikde süýümli optik kabel arkaly çykarylýar we 90° burç bilen ýagtylyk çeşmesine çykarylýar. Ölçeg şöhlesi nusga tarapyndan ilki siňdirilmedik islendik ýagtylygy gaýtarmak üçin aýna garşy goýulýar. 50 sekunt ýagtylykdan öň siňdirilişi 10 sekunt gözegçilik ediň. Soňra siňdirilişi garaňkyda 60 sekuntlap ​​gözegçilik edilip, hinololyň sitohrom c23+-i öz-özünden nähili derejede azaltýandygyny bahalandyryldy (çig maglumatlar üçin S8 suratyna serediň).
Maglumatlar 0,5-10 sekunt aralygynda (UQ2 konsentrasiýasyna baglylykda) çyzykly başlangyç tizligi sazlamak we her UQ2 konsentrasiýasynda üç nusganyň hem tizliklerini ortaça hasaplamak arkaly işlenildi. Degişli ýok edilme koeffisiýenti bilen hasaplanan RC-LH1 konsentrasiýasy tizligi katalitik netijelilige öwürmek üçin ulanyldy, bu Origin Pro 2019-da (OriginLab, ABŞ) görkezildi we görünýän Km we Kcat gymmatlyklaryny kesgitlemek üçin Michaelis-Menten modeline laýyklaşdyryldy.
Wagtlaýyn siňdiriş ölçegleri üçin RC-LH1 nusgasy 50 mM natriý askorbatyny (Merck, ABŞ) we 0,4 mM Terbutini (Merck, ABŞ) öz içine alýan IMAC buferinde ~2μM çenli suwlandyryldy. Askorbin turşusy gurbanlyk elektron donor hökmünde ulanylýar we tert-butaklofen esasy RC donorynyň ölçeg prosesinde reduksirlenen (ýagny fotooksidlenmedik) bolmagyny üpjün etmek üçin QB ingibitory hökmünde ulanylýar. Lazer ýolundaky nusganyň oýarma impulslarynyň arasynda garaňky adaptasiýa üçin ýeterlik wagta eýe bolmagyny üpjün etmek üçin 2 mm optiki ýol uzynlygy bolan ýörite aýlanýan öýjükde (diametri takmynan 0,1 m, 350 RPM) takmynan 3 ml nusga goşulýar. Nusgany 880 nm-de 1 kHz gaýtalanma tizliginde (NIR üçin 20 nJ ýa-da Vis üçin 100 nJ) oýarmak üçin Ti: Sapphire lazer ulgamyny (Spectra Physics, ABŞ) güýçlendirmek üçin ~100-fs lazer impulslaryny ulanyň. Maglumat ýygnamazdan öň, nusgany takmynan 30 minutlap gyjyndyryjy ýagtylyga goýuň. Ekspozisiýa QA-nyň inaktiwleşmegine sebäp bolar (mümkin, QA-ny ​​bir ýa-da iki gezek azaldyp biler). Emma bu prosessiň yzyna gaýtaryp bolýandygyny ýadyňyzdan çykarmaň, sebäbi uzak wagtlap garaňky adaptasiýadan soň, RC ýuwaş-ýuwaşdan QA işjeňligine gaýdyp geler. -10-dan 7000 ps-e çenli gijikme wagty bolan geçiş spektrlerini ölçemek üçin Helios spektrometri (Ultrafast Systems, ABŞ) ulanyldy. Maglumat toplumlaryny toparlardan aýyrmak, soňra birleşdirmek we standartlaşdyrmak üçin Surface Xplorer programma üpjünçiligini (Ultrafast Systems, ABŞ) ulanyň. Çöküş bilen baglanyşykly differensial spektrleri almak üçin birleşdirilen maglumat toplumyny ulanmak üçin CarpetView programma üpjünçiligini (Light Conversion Ltd., Litwa) ulanyň ýa-da Origin-däki (OriginLab, ABŞ) bir tolkunly spektral ewolýusiýa laýyk gelmek üçin enjamyň jogaby bilen köp sanly eksponentleri birleşdirýän funksiýany ulanyň.
Ýokarda agzalyp geçilişi ýaly (53), RC we periferik LH2 antennasy bolmadyk LH1 kompleksini öz içine alýan fotosintetik plýonka taýýarlanyldy. Membran 20 mM trisde (pH 8.0) suwlandyryldy we soňra 2 mm optiki ýoly bolan kwars küwetasyna ýüklendi. Nusgany 540 nm-de -10-dan 7000 ps-e çenli gijikdiriş wagty bilen oýarmak üçin 30nJ lazer impulsy ulanyldy. Maglumatlar toplumyny Rps. pal nusgasy üçin beýan edilişi ýaly işleň.
Membrana 150,000 RCF-de 4°C-de 2 sagatlap santrifuga arkaly granulalaşdyryldy, soňra onuň 880 nm-däki siňdirilişi 20 mM tris-HCl (pH 8.0) we 200 mM NaCl-de gaýtadan suspenziýa edildi. Membrana 2% (w/v) β-DDM-i 4°C-de garaňky ýerde 1 sagatlap ýuwaş-ýuwaşdan garyşdyryp erediň. Nusga 100 mM trietilamonium karbonatda (pH 8.0) (TEAB; Merck, Beýik Britaniýa) 2.5 mg ml-1 belogyň konsentrasiýasyna çenli eredildi (Bio-Rad analizi). Mundan beýläk gaýtadan işlemek öň çap edilen usuldan (54) geçirildi, 50 μg belogy 1% (w/v) natriý lauratyny öz içine alýan jemi 50 μl TEAB-a eredmekden başlady (Merck, Beýik Britaniýa). 60 sekuntlap ​​ultrases bilen işlenenden soň, ol 37°C-da 30 minutlap 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Beýik Britaniýa) bilen reduksiýa edildi. S-alkilirlemek üçin nusgany 10 mM metil S-metiltiometansulfonat (Merck, Beýik Britaniýa) bilen inkubasiýa ediň we ony 200 mM izopropanol önüm ergininden otag temperaturasynda 10 minutlap goşuň. Proteolitik siňdiriş 2 μg tripsin/endoproteinaza Lys-C garyndysyny (Promega Beýik Britaniýa) goşmak we 37°C-da 3 sagatlap inkubasiýa etmek arkaly amala aşyryldy. Laurat surfaktant 50 μl etil asetat we 10 μl 10% (g/g) LC derejeli triftorsirke turşusyny (TFA; Thermo Fisher Scientific, Beýik Britaniýa) goşmak we 60 sekuntlap ​​wortalamak arkaly çykaryldy. Faza bölünişi 15,700 RCF-de 5 minutlap santrifugalamak arkaly güýçlendirildi. Öndürijiniň protokolyna laýyklykda, peptidi öz içine alýan aşaky fazany üns bilen aspirirlemek we duzsuzlaşdyrmak üçin C18 spin kolonkasy (Thermo Fisher Scientific, Beýik Britaniýa) ulanyldy. Wakuum santrifugalamak arkaly guradylandan soň, nusga 0,5% TFA we 3% asetonitrilde eredildi we 500 ng öň jikme-jik beýan edilen ulgam parametrlerini ulanyp, nanoflow RP hromatografiýasy bilen massa spektrometriýasy arkaly seljerildi.
Rps. palustris proteome maglumat bazasyny (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) gözlemek üçin belogy kesgitlemek we mukdaryny kesgitlemek üçin MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ulanyň. Mass spektrometriýasy proteomikasy maglumatlary PXD020402 maglumat toplumy identifikatory astynda PRIDE hyzmatdaş repozitoriýasy (http://proteomecentral.proteomexchange.org) arkaly ProteomeXchange Bileleşigine ýerleşdirildi.
RPLC arkaly elektropreý ionizasiýa massa spektrometriýasy bilen utgaşdyrylan analiz üçin, RC-LH1 toplumy ýabany görnüşli Rps-den taýýarlanyldy. Öň çap edilen usuly (16) ulanyp, palustris öýjüklerinde öndürilen belogyň konsentrasiýasy 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl we 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analizi)) DDM-de 2 mg ml-1 boldy. Öndürijiniň protokolyna laýyklykda, çökündi usuly bilen 10 μg belogy çykarmak üçin 2D arassalaýyş toplumyny (GE Healthcare, ABŞ) ulanyň we çökündini 20 μl 60% (v/v) formik turşusynda (FA), 20% (v/v) asetonitrilde we 20% (v/v) suwda erediň. Bäş mikrolitr RPLC (Dionex RSLC) arkaly massa spektrometriýasy (Maxis UHR-TOF, Bruker) bilen utgaşdyrylan analiz edildi. 60°C we 100μlmin -1 temperaturada bölmek üçin MabPac 1.2×100 mm sütünini (Thermo Fisher Scientific, Beýik Britaniýa) ulanyň, 85% (v / v) ergin A [0.1% (v / v) FA we 0.02% (V/v) TFA suwly ergini] 85% (v/v) ergin B [90% (v/v) asetonitril TFA-da 0.1% (v/v) FA we 0.02% (v/v)] gradienti bilen. Standart elektrospreý ionlaşma çeşmesini we standart parametrleri 60 minutdan köp ulanyp, massa spektrometri 100-den 2750 m/z-e çenli (massa-zarýad gatnaşygyny) alýar. ExPASy bioinformatika resurs portaly FindPept guralynyň (https://web.expasy.org/findpept/) kömegi bilen massa spektrini kompleksiň kiçi birliklerine kartalaşdyryň.
Öýjükler 100 ml NF-pes (10μMm-2 s-1), orta (30μMm-2 s-1) ýa-da ýokary (300μMm-2 s-1) ýagtylykda 72 sagatlap ösdürildi. M22 gurşawy (ammoniý sulfaty goşulmadyk we natriý suksinaty natriý asetat bilen çalşyrylan M22 gurşawy) 100 ml-lik burmaly gapda (23). Bäş 30 sekuntlyk siklde öýjükleri lizis etmek üçin 0,1 mikronly aýna munçuklar 1:1 göwrüm gatnaşygynda munçuklar bilen çalşyryldy we 5 minutlap buzda sowadyldy. Eremeýän maddalar, döwülmedik öýjükler we aýna munçuklar stoluň üstünde işleýän mikrosentrifugada 16,000 RCF-de 10 minutlap santrifugalamak arkaly aýryldy. Membran Ti 70.1 rotorynda 100,000 RCF bilen 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde 40/15% (w/w) saharoza gradienti bilen 10 sagatlap bölündi.
Öňki işimizde beýan edilişi ýaly, PufW-da His teginiň immunodektiwasy (16). Gysgaça aýdylanda, 2x SDS ýükleme buferinde (Merck, Beýik Britaniýa) arassalanan esasy kompleks (11.8 nM) ýa-da şol bir konsentrasiýaly RC-ni öz içine alýan membrana (okislenme arkaly azaldylan tapawut spektrini aýyrmak we reňklenen geldäki ýüki deňeşdirmek arkaly kesgitlenýär) iki gezek suwuklandyryldy. Beloklar 12% bis-tris NuPage geliniň (Thermo Fisher Scientific, Beýik Britaniýa) nusgasynda bölündi. RC-L kiçi birligini ýüklemek we görselleşdirmek üçin gel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Beýik Britaniýa) bilen boýaldy. Ikinji geldäki belok immunoassaýz üçin metanol bilen aktiwleşdirilen poliwiniliden ftorid (PVDF) membranasyna (Thermo Fisher Scientific, Beýik Britaniýa) geçirildi. PVDF membranasy 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (g/g) Tween-20 we 5% (w/g) süýt poroşogynda blokirlendi, soňra anti-His esasy antitela bilen (1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ABŞ-da, Suwuklandyrylan antitela buferinde [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl we 0.05% (g/g) Tween-20]) 4 sagatlap inkubasiýa edildi. Antitela buferinde 5 minutlap 3 gezek ýuwulandan soň, membrana hren peroksidazasy (Sigma-Aldrich, Beýik Britaniýa) syçanlara garşy ikinji derejeli antitela (antitela buferinde 1:10,000 suwuklandyrylan) bilen birleşdirildi. WESTAR ETA C 2.0 himiluminesensiýa substratyny (Cyanagen, Italiýa) we Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Beýik Britaniýa) ulanyp, anyklamaga mümkinçilik bermek üçin (antitela buferinde 3 gezek ýuwulandan soň 5 minut) inkubasiýa edildi.
ImageJ (57)-de her bir boýalan geliň ýa-da immunoassay zolagynyň intensiwlik paýlanyşyny çyzyp, pikiň aşagyndaky meýdany birleşdirip we RC-L (boýalan gel) we Protein-W (immunoassay) intensiwlik gatnaşygyny hasaplap, suraty işlemeli. Bu gatnaşyklar arassa RC-LH114-W nusgasynda RC-L-iň protein-W-e gatnaşygynyň 1:1 bolandygyny çaklap we ähli maglumat toplumyny şoňa görä normallaşdyrmak arkaly molar gatnaşyklara öwrüldi.
Bu makala üçin goşmaça materiallar üçin http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 salgysyna serediň.
Bu Creative Commons Attribution License şertlerine laýyklykda ýaýradylýan açyk girişli makaladyr. Makala asyl eseriň degişli sitirlenme şerti bilen islendik serişdede çäklendirilmedik ulanmaga, ýaýratmaga we köpeltmäge rugsat berýär.
Bellik: Sahypa maslahat berýän adamyň e-poçtany görmegini isleýändigiňizi we onuň spam däldigini bilmegi üçin diňe e-poçta salgyňyzy bermegiňizi haýyş edýäris. Biz hiç hili e-poçta salgylaryny hasaba almarys.
Bu sorag siziň myhmandygyňyzy barlamak we awtomatiki spam iberilmeginiň öňüni almak üçin ulanylýar.
Deýwid JK Sweinsbury, Park Qian, Filip J. Jekson, Keýtlin M. Faries, Dariuş M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Deýwid A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebekka F. Tompson, Neil A. Ranson, Daniel P Kanniff, Mark J. Dikman, Deweý Holten, Kristin Kirmaýer, Endrýu Hiçkok, C. Neil Hanter
Reaksiýa merkezinde ýerleşýän 1-nji ýagtylyk duzagy toplumynyň ýokary çözgütli gurluşy hinon dinamikasyna täze düşünjeleri berýär.
Deýwid JK Sweinsbury, Park Qian, Filip J. Jekson, Keýtlin M. Faries, Dariuş M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Deýwid A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebekka F. Tompson, Neil A. Ranson, Daniel P Kanniff, Mark J. Dikman, Deweý Holten, Kristin Kirmaýer, Endrýu Hiçkok, C. Neil Hanter
Reaksiýa merkezinde ýerleşýän 1-nji ýagtylyk duzagy toplumynyň ýokary çözgütli gurluşy hinon dinamikasyna täze düşünjeleri berýär.
© 2021 Ylmyň ösüşi üçin Amerikan birleşigi. ähli hukuklar goralandyr. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef we COUNTER-iň hyzmatdaşy. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.